4種雜糧提取物組分分析及體外降脂功能評價

姚軼俊, 李枝芳, 王 博, 王立峰, 鞠興榮

(江南大學食品學院1，無錫 214122) (南京財經大學食品科學與工程學院；江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心2，南京 210023)

中國的雜糧總產量占世界粗糧總產量的17.1%，薏米、赤小豆、青稞、蕎麥是4種具有我國特色的雜糧。薏米殼提取物已被證明其酚類成分部分與抗氧化和抗炎活性有關，薏米有可能成為一種針對慢性疾病的功能性食品[3]。德國營養協會最近證明全谷類食物可以降低低密度脂蛋白膽固醇，能減少Ⅱ型糖尿病的風險，在一定程度上減少了成年人肥胖的風險，但針對減少代謝綜合征的風險證據不足[4]。現代藥理學研究證明，赤小豆具有抗氧化[5]、降血糖[6]、降血脂[7]的作用。青稞中含有多種活性物質，如酚類化合物、黃酮類化合物，β-葡聚糖、γ-氨基丁酸等[8]。洛桑旦達等[9]對我國75個品種青稞中的β-葡聚糖含量進行測定，得到不同品種β-葡聚糖的平均質量分數為5.25%，質量分數最高的品種達8.62%，相較于國外上百個品種的β-葡聚糖含量測定結果，西藏青稞的β-葡聚糖含量最高。蕎麥是一種營養豐富、藥用價值極高的植物。甜蕎蛋白是甜蕎麥中的主要營養成分之一，同時也是目前甜蕎麥的一個重要的研究方向[10]。蘆丁是苦蕎中含量最豐富的多酚類物質之一，蘆丁具有降低毛細血管脆性，改善微循環的作用，在臨床上被用于糖尿病和高血壓的輔助性治療。苦蕎麥中還包含了豐富的生物類黃酮、礦物質、維生素、膳食纖維等活性物質，其中膳食纖維質量分數高達1.6%，是普通米面的8倍多[11]。

近年來，相關研究發現雜糧具有良好的降脂功能，其中含有的一些生物活性成分能有效改善脂質代謝異常導致的相關疾病。因此研究人員開始聚焦于谷物飲食對健康的影響[12]。相關研究表明，雜糧中富含的多酚類物質可以通過調節機體脂質代謝從而降低血脂，有效預防心血管疾病的發生[13]。此外，雜糧中膳食纖維的攝入有助于改善腸道菌群的構成，其中益生菌的發酵會給人體帶來所必需的營養物質。因此，本實驗以薏米、赤小豆、青稞、蕎麥為原料，對其提取物中的可溶性總糖、蛋白質、氨基酸、總酚、總黃酮含量進行分析。并通過構建高脂HepG2細胞模型，以TG、T-CHO、LDL-C、AST、ALT作為指標，對其降脂功能進行評價，進一步明確幾種我國特色糧食作物的營養價值，為肥胖人群的膳食提供一定的指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

薏米(遼寧5號Coixlachryma-jobiL.)、赤小豆(天津紅AbrusprecatoriusL.)、青稞(北青3號HordeumvulgareLinn. var. nudum Hook.f.)、蕎麥(大三棱FagopyrumesculentumMoench.)，當季采收后在陰涼避光條件下儲藏，并在3個月內使用。人體HepG2肝癌細胞株、DMEM培養基、胎牛血清(FBS)、青霉素-鏈霉素溶液、0.25%胰蛋白酶消化液、脂肪酶測試盒 (A054-2)、甘油三酯(TG)測試盒 (A110-1)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)測試盒(A111-1)、總膽固醇(T-CHO)測試盒(A112-1)、GOT試劑盒(C010-2, 酶標儀法)、GPT試劑盒(C009-2, 酶標儀法)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(A1933-5)、牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin)，試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

DFT-50A粉碎機，SHZ-82A水浴恒溫振蕩器，SpectraMax M2e多功能酶標儀，K-360凱式定氮儀，TG16-WS臺式高速離心機，SN-210高壓滅菌鍋，ST-16 高速冷凍離心機，CIB-191C CO2培養箱，倒置生物顯微鏡，SJ-CJ-2FD生物超凈工作臺。

1.3 方法

1.3.1 雜糧提取物的制備

將薏米、赤小豆、青稞、蕎麥洗凈烘干，磨粉過60目篩，用紗布包裹并一同置于燒杯中，加入正己烷，料液比1∶4，水浴1 h，水浴溫度60 ℃，脫去多余的脂質。取出紗布包，加入蒸餾水，料液比為1∶8，水浴4 h，水浴溫度70 ℃；取出紗布包，將水提物離心收取上清液，離心轉速為6 000 r/min，離心時間為10 min，重復離心2次；所取得的上清液旋轉蒸發除去有機溶劑，再經冷凍干燥得到4種雜糧提取物粉末。

1.3.2 蒽酮比色法測定雜糧提取物的可溶性總糖含量

標準曲線的制作：將葡萄糖在80 ℃的烘箱中烘至質量恒定，取0.1 g定容至100 mL，再取出10 mL，定容至100 mL，即可得到0.1 mg/mL的葡萄糖標準溶液，分別取葡萄糖標準溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8 mL，用蒸餾水定容到1 mL，再分別加入蒽酮試劑5 mL，沸水浴中加熱10 min，在620 nm波長中進行測定。以OD值為縱坐標，葡萄糖標準液濃度為橫坐標，作圖得到葡萄糖的標準曲線。

4種雜糧可溶性總糖的提取及測定：分別準確稱取0.1 g的薏米粉、赤小豆粉、青稞粉和蕎麥粉，并加入50 mL質量分數為80%的乙醇，恒溫45 ℃加熱10 min，取其濾液1 mL，同時用蒸餾水做空白對照，冷卻后備用。測定4種雜糧中可溶性總糖的含量，計算公式為：

可溶性總糖質量分數(以葡萄糖計)=p×稀釋倍數×10-4×100%

式中：p為從標準曲線中查得的糖質量濃度/μg/mL；10-4為將μg/mL換成百分數的系數。

1.3.3 雜糧提取物中蛋白質及氨基酸含量的分析

蛋白質含量測定參考GB 5009.5—2016。將4種雜糧用料理機進行勻漿，放置于低溫冰箱中冷凍保存，使用時再將其解凍。準確稱取一定量的樣品，精確到0.000 1 g，在水解管內加入15 mL 6 mol/L鹽酸，加入新蒸餾的苯酚3滴，再將水解管放入冷凍劑中，冷凍5 min，在接到真空泵的抽氣管上，抽真空后充入高純氮氣，重復3次后封口。將封好口的水解管放在110 ℃的恒溫干燥箱內水解22 h，取出冷卻，過濾水解液轉移到50 mL容量瓶內，用去離子水定容。吸取1 mL濾液放入5 mL容量瓶內，在45 ℃的真空干燥器中干燥，殘留物用1 mL水溶解，再進行干燥，重復2次最后蒸干后用1 mL pH 2.2的緩沖溶液溶解，供儀器測定用。準確吸取0.2 mL混合氨基酸標準，用pH 2.2的緩沖液稀釋到5 mL，此標準稀釋濃度為5 nmol/50 μL，作為上機測定用的氨基酸標準，用氨基酸自動分析儀以外標法測定樣品測定液的氨基酸含量。

1.3.4 雜糧提取物的總酚及總黃酮含量測定

總酚測定：取4種雜糧各個階段提取物的凍干樣品0.1 g，溶于1 mL 80% 丙酮后，過0.45 μm的濾膜，用蒸餾水稀釋10倍后，加入1 mL的5倍稀釋的福林酚試劑混勻，反應5 min后加入2 mL的15% Na2CO3溶液，用蒸餾水定容到10 mL，避光2 h，用酶標儀測定760 nm下的吸光度。標準曲線的繪制：稱取0.1 g的沒食子酸標準品，用蒸餾水定容于100 mL的容量瓶，然后從容量瓶中再取5 mL用蒸餾水定容到50 mL的容量瓶中。分別取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的沒食子酸標準溶液(0.1 mg/mL)加入1 mL的5倍稀釋的福林酚試劑混勻，反應5 min后加入2 mL的15% Na2CO3溶液，用蒸餾水定容到10 mL，避光2 h，用酶標儀在96孔板上每孔150 μL測定760 nm下的吸光度。以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標作標準曲線，得回歸方程y=82.89x+0.044，R2=0.999。總酚含量以每克薏米等同于沒食子酸(GAE)的毫克數表示[14]。

總黃酮測定：準確稱取蘆丁標準品15 mg，用50%乙醇溶解并定容至50 mL，得到質量濃度為0.3 mg/mL的蘆丁標準溶液。取7支試管編號，分別按表1中所給的量加入各種試劑，并測定其吸光值。加入5% NaNO2溶液0.4 mL后，搖勻，放置6 min；加入10% Al(NO3)3溶液0.4 mL后，搖勻，放置6 min；加入5% NaOH溶液4 mL，再加入2.2 mL蒸餾水，搖勻，放置15 min。以0號試管為空白，于510 nm處測吸光值。以蘆丁的含量(mg/mL)為橫坐標，OD值為縱坐標繪制標準曲線[15]。

1.3.5 細胞培養

HepG2細胞培養在含8% 胎牛血清、50 units/mL青霉素和50 μg/mL鏈霉素的DMEM培養液中，培養環境為37 ℃，5% CO2。

1.3.6 細胞毒性測試(MTT)

采用MTT法對薏米、赤小豆、青稞、蕎麥的提取物進行細胞毒性實驗。將HepG2細胞以5 000～10 000 cells/孔的數量接種到96孔板中，每孔100 μL，邊緣用PBS填充，鋪好板后蓋上蓋子，十字搖勻，不要旋轉搖晃，于CO2培養箱(5% CO2、37 ℃)中培養24 h。將4種雜糧的消化產物用培養液溶解，配置成不同的梯度，換掉96孔板中的培養液，加入樣品液，不含樣品的培養液視為對照組。每孔100 μL，設5個重復。繼續培養24 h后，吸棄上清液，每孔加入120 μL MTT(0.1 mg/mL)溶液，繼續培養4 h。終止培養，小心吸棄孔內液體，每孔加入100 μL DMSO，置于搖床上低速振蕩10 min或置于培養箱中30 min，使結晶充分溶解。酶標儀下檢測490 nm下各孔的吸光值[13]。實驗中設凋零孔、對照孔及加藥孔。凋零孔：不含細胞的完全培養基、MTT、DMSO；對照孔：細胞懸液、藥物溶劑、MTT、DMSO；實驗孔：細胞懸液、不同雜糧提取物、MTT、DMSO。

1.3.7 HepG2高脂細胞模型建立及降脂活性測定

蛋白吸附法配制油酸溶液：70 ℃振蕩水浴下將油酸溶于0.1 mmol/L NaOH中，配成 100 mmol/L 的儲存液；55 ℃振蕩水浴下將儲存液滴入10% BSA 的PBS溶液中，配成濃度5 mmol/L的使用液，過濾除菌，-20 ℃ 冷凍保存，使用前55 ℃水浴15 min并冷卻至室溫，用完全培養基稀釋至0.25 mmol/L。將 HepG2 細胞接種于6孔板，孵育24 h后取出，對照組加含8%～10% FBS的高糖DMEM培養基，模型組加入含終濃度2.5 mmol/L油酸的8%～10% FBS高糖DMEM培養基，繼續培養24 h，高脂模型構建完成[13,16]。

細胞經分組培養后，分別加入4種雜糧提取物，并設置空白對照。繼續培養24 h后，吸除培養液，PBS輕柔洗滌3次，加入IP細胞裂解液，冰浴裂解細胞30 min，按照甘油三酯(TG)、總膽固醇(T-CHO)、低密度脂蛋白(LDL-C)、天冬氨酸轉氨酶(AST)和丙氨酸轉氨酶(ALT)試劑盒操作說明測定細胞內照甘油三酯(TG)、總膽固醇(T-CHO)、低密度脂蛋白(LDL-C)、天冬氨酸轉氨酶(AST)和丙氨酸轉氨酶(ALT)的含量。按照BCA蛋白濃度測定試劑盒操作說明測定細胞中蛋白質含量。用蛋白含量校準細胞中甘油三酯(TG)含量。

1.4 數據統計分析

采用SPSS 20.0軟件進行數據分析，結果均表示為“平均值±標準偏差”，應用GraphPad 7.0進行圖形繪制，每組實驗重復3次。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

注：不同小寫字母表示相同指標下4種雜糧差異顯著(P<0.05)，余同。圖1 薏米、赤小豆、青稞、蕎麥提取物中的蛋白質及可溶性總糖含量

2 結果與分析

2.1 4種雜糧中蛋白質及可溶性總糖含量的分析

薏米、赤小豆、青稞和蕎麥提取物中所含有的蛋白質及可溶性總糖含量如圖1所示。其中赤小豆和青稞提取物中所含的可溶性總糖最高可達到39.43%和40.24%。赤小豆和青稞提取物中的可溶性總糖含量相當，薏米提取物次之，蕎麥提取物最少。采用蒽酮比色法測定4種雜糧提取物中可溶性總糖的含量，利用強酸可使糖類脫水成糖醛，生成的糖醛或羥甲基糖醛與蒽酮脫水縮合，形成藍綠色的糖醛衍生物來測定[17]。可溶性糖如葡萄糖在植物的生命周期中具有重要作用。它不僅為植物的生長發育提供能量和代謝中間產物，而且具有信號功能，它也是植物生長發育和基因表達的重要調節因子[18]。從蛋白質總量上來看，薏米和蕎麥提取物中的蛋白質質量分數較高，分別可以達到7.79% 和7.66%。青稞提取物中蛋白質的含量次之，赤小豆提取物中含有的蛋白質含量最低。有研究結果證明，赤小豆的礦物質價值要比赤豆高，如赤小豆的鈣、鋅含量是赤豆的3.1倍和1.6倍，但赤小豆的粗蛋白含量比赤豆低13.95 g/100 g[19]。

2.2 4種雜糧提取物中氨基酸含量的分析

由表1可知，4種雜糧提取物中含有16種氨基酸，其中7種為必需氨基酸，9種為非必需氨基酸。其中蕎麥提取物中谷氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、甘氨酸和精氨酸含量較高。青稞提取物中半胱氨酸、纈氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的含量較高。赤小豆提取物中甲硫氨酸和賴氨酸的含量較高。薏米提取物中丙氨酸、亮氨酸和組氨酸的含量較高。谷氨酸是肌肉中最豐富的游離氨基酸，約占人體游離氨基酸總量的60%。谷氨酸被人體吸收后可以與血氨形成谷酰氨，能解除代謝過程中的氨毒害作用，因而能預防和治療肝損傷[20]。天冬氨酸參與鳥氨酸循環，促進氧和二氧化碳生成尿素，降低血液中氮和二氧化碳的量，增強肝臟功能，消除疲勞。L-半胱氨酸是一種氨基酸類解毒藥，它參與細胞的還原過程和肝臟內的磷脂代謝，有保護肝細胞不受損害，促進肝臟功能恢復和旺盛的藥理效應[21]。纈氨酸能促進身體正常生長，修復組織，調節血糖，并提供需要的能量[22]。蕎麥提取物中含量較多的氨基酸，如谷氨酸和天冬氨酸，對人體的肝臟有很好的保護作用。青稞提取物中富含的氨基酸，如半胱氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等，可用于面團改良劑、食品添加劑等。

Emebiri等[23]在研究谷物中天冬氨酸含量的遺傳變化率時發現92個品種的谷物中游離天冬氨酸含量為137～471 mg/kg。本實驗結果表明，薏米和青稞提取物中天冬氨酸的含量為99.3、128.4 mg/kg，與其結果相較偏低，這可能是由于谷物品種的原因，日照時間、生長周期、成熟度等都會影響，與國外品種在成分組成上可能略有差異。

表1 薏米、赤小豆、青稞蕎麥提取物中的氨基酸含量/g/100 g

2.3 4種雜糧提取物中總酚及總黃酮含量的分析

圖2結果表明，青稞提取物中的總酚含量最高可以達到84.24 mg GAE/100 g；薏米和赤小豆提取物中的總酚含量次之，為83.21、81.17 mg GAE/100 g；蕎麥提取物中的總酚含量最低68.54 mg GAE/100 g。因為多酚的酚羥基結構中的鄰位酚羥基很容易被氧化成醌類結構，并在此過程中消化環境中的氧，同時捕捉活性氧等自由基，所以多酚含量的多少與其抗氧化能力成正比[24]。

圖2 薏米、赤小豆、青稞、蕎麥提取物中的總酚含量

圖3 薏米、赤小豆、青稞、蕎麥提取物中的總黃酮含量

如圖3所示，赤小豆提取物中總黃酮含量最高 (34.794 mg RE/100 g)。這可能與赤小豆的種皮有關。赤小豆種皮含有多種潛在生物活性的色素，包括多酚類物質，如原花青素[25]。這也是赤小豆中總黃酮含量最高的原因。蕎麥提取物的總黃酮含量次之，為32.57 mg RE/100 g；薏米和青稞提取物中的總黃酮含量較少，分別為13.49 mg RE/100 g和7.81 mg RE/100 g。目前，類黃酮作為抗氧化劑和自由基清除劑被廣泛應用。如王蘭等的研究表明，葛根異黃酮具有降血糖活性，能夠使糖尿病小鼠的抗氧化能力增強，改善糖尿病小鼠的糖脂代謝，對其有很好的保護作用[26]。

2.4 4種雜糧提取物對HepG2細胞毒性測試

很多研究證明雜糧具有一些潛在的功能，如抗氧化，抗肥胖和抗炎。然而，也有一些抗營養因素可能產生某些不良反應[27]。當它們被濃縮時，可能引起免疫反應并被代謝生成有毒產物[28]。因此，有必要評估其對HepG2細胞的安全性。如圖4所示，隨著青稞提取物濃度的升高HepG2細胞的存活率在逐漸下降。當從青稞提取物的濃度高于1 000 μg /mL，HepG2細胞生存開始低于90%，這個結果表明添加物的劑量對于維持HepG2細胞處于一個良好的生存狀態十分重要的。Rao等[29]證明麥片甲醇提取物濃度為500 μg/mL時對人類結腸癌細胞株沒有表現出任何明顯的細胞毒作用。然而，本實驗采用了一種更加簡單安全的方法，水提取，使提取物具有更高的安全性。在陳超等的研究中用丙酮提取脫脂后的薏米當其質量濃度達到25～500 μg/mL時，HepG2細胞的活力就開始明顯地被抑制[30]。但是采用水提法提取的組分當其濃度達到5 mg/mL時，HepG2細胞顯示仍然沒有毒性。因此鑒于提取方法，當4種雜糧提取物質量濃度為1 000 μg/mL時，對于HepG2不產生細胞毒性。

圖4 薏米、赤小豆、青稞、蕎麥的提取物對細胞活力的影響

2.5 4種雜糧提取物對HepG2高脂細胞內TG、T-CHO、LDL-C、AST和ALT水平的影響

油酸誘導的HepG2細胞內的TG和T-CHO濃度較正常的HepG2細胞明顯升高，如圖5所示。油酸誘導后，細胞內TG和T-CHO含量明顯升高，4種種雜糧提取物的添加均有效地降低了其TG和T-CHO的濃度。與沒有添加雜糧提取物的高脂細胞相比較，薏米提取物、赤小豆提取物、青稞提取物和蕎麥提取物分別使高脂細胞內的甘油三酯的含量降低了36.5%、24.4%、34.4%和16.9%。在針對降低細胞內甘油三酯的功能上來看薏米和青稞的提取物的效果更為突出。高脂細胞內T-CHO的含量在添加了薏米、赤小豆、青稞、蕎麥提取物后，T-CHO的質量分數分別降低了11.4%、11.5%、21.4%、5.9%。其中綜合來看青稞提取物的作用效果最為顯著。青稞提取物處理后細胞內TG和T-CHO含量較油酸對照組明顯降低。結果表明，與未加1 mg/mL青稞提取物的高脂血癥HepG2細胞相比，細胞內TG質量分數降低34.4%，T-CHO質量分數降低21.4%。Veronika等[31]研究了青稞中的β-葡聚糖對小鼠膽固醇代謝的影響。結果表明，經β-葡聚糖處理后，TG降低24.14%，T-CHO降低15.53%。相比之下，實驗中從青稞中提取的混合物比單一的β-葡聚糖效果更好。青稞提取物中含有豐富的多酚類物質，能有效降低甘油三酯的含量。

圖5 薏米、赤小豆、青稞、蕎麥的提取物對經過油酸處理的HepG2細胞內甘油三酯和總膽固醇的影響

圖6 薏米、赤小豆、青稞、蕎麥的提取物對經過油酸處理的HepG2細胞內低密度脂蛋白的影響

如圖6所示，經油酸處理后，低密度脂蛋白的含量顯著升高，是對照組含量的約2.3倍，在加入4種雜糧的提取物后，其含量都有明顯的降低，可以觀察到青稞提取物的效果尤為顯著，經青稞提取物處理后LDL-C降低了51.8%。薏米提取物、赤小豆提取物和蕎麥提取物的添加分別使高脂細胞中低密度脂蛋白的質量分數降低了21.8%、26.1%和10.6%。

天冬氨酸轉氨酶和丙氨酸轉氨酶是肝臟健康的指標。只要有1%的肝細胞壞死，血液中的酶活性就會增加1倍，所以尤其是丙氨酸轉氨酶是急性肝細胞損傷的敏感標志物。從圖7可以看出，青稞和蕎麥的提取物可以明顯地降低AST的含量，經過青稞和蕎麥提取物處理后AST分別下降了21%和16.8%，而薏米和赤小豆提取物對AST的效果并不明顯。細胞內ALT的含量在經油酸誘導后有極其顯著的上升，4種雜糧的提取物均有效地降低了其含量，與沒有添加雜糧提取物的細胞相比，添加了薏米、赤小豆、青稞和蕎麥提取物的細胞中ALT的質量分數分別降低了35.2%、28.1%、51.5%和44.3%。其中青稞提取物的效果更為突出，有研究表明酚酸是青稞中的主要酚類物質，大部分集中在麩皮和胚芽，蘆丁、阿魏酸、p-香豆酸和表兒茶素是青稞總多酚提取物中的主要成分，可增強小鼠體內抗氧化防御系統以及棕色脂肪相關基因表達[32]。青稞對細胞內AST和ALT降低有顯著的作用，進而對肝臟有很好的保護作用，也可能與青稞中富含的酚酸類活性成分的組成以及相對含量有關。將在后期的實驗中利用該質譜技術分析其中全部的酚酸化合物，并結合體內實驗利用分子生物技術進一步研究其調控脂質代謝的作用機理。

圖7 薏米、赤小豆、青稞、蕎麥的提取物對經過油酸處理的HepG2細胞內天冬氨酸轉氨酶和丙氨酸轉氨酶的影響

3 結論

對4種雜糧進行了脫脂提取，系統分析了其提取物的組分含量，并基于HepG2高脂模型對其降脂功能進行評價。結果表明，赤小豆和青稞提取物中的可溶性總糖含量相當，薏米提取物次之，蕎麥提取物最少。此外，青稞提取物中的總酚含量最高可以達到84.24 mg GAE/100 g；赤小豆由于其種皮含有多種潛在生物活性的色素，因此其提取物中總黃酮含量最高(34.794 mg RE/100 g)。4種雜糧提取物在一定程度上均能有效降低高脂細胞內TG、LDL-C、T-CHO、AST、ALT的含量。從整體上看，青稞提取物的效果較為突出，青稞提取物處理后細胞內TG和T-CHO含量較油酸對照組明顯降低。結果表明，與對照組相比，添加1 mg/mL青稞提取物后，高脂HepG2細胞細胞內TG質量分數降低34.4%，T-CHO質量分數降低21.4%，LDL-C降低了51.8%，ALT下降51.5%，AST下降21%，表現出最佳的降脂功能。因此后續將對青稞的活性成分進行進一步的探究，通過對機體內相關通路的調控作用探明其降脂機理。