釓攜帶劑用于中子俘獲治療的現狀及進展

韓 祎，崔大慶,2,*，李紀元，劉志博,4,*

1.中國原子能科學研究院 放射化學研究所，北京 102413；2.斯德哥爾摩大學 材料與環境化學系，瑞典 SE-106 91；3.北京大學 化學與分子工程學院，北京 100871；4.北京大學-清華大學生命聯合中心，北京 100871

中子俘獲治療(neutron capture therapy, NCT)是一種二元的、分子靶向的放射治療法，對局部侵襲性惡性腫瘤如黑色素瘤、膠質母細胞瘤和復發性頭頸部腫瘤提供了良好的腫瘤控制治療方案。它的原理是利用可以與中子發生俘獲反應的核素，在反應后放出射線，從而殺死腫瘤細胞而使患者生存期得以延長，這促進了NCT的發展和臨床應用。鑭系元素Gd因其在4f殼層[1]有7個未配對電子，所以有著非常強的弛豫效應和順磁特性。在穩定同位素中，157Gd(天然豐度15.7%),有著最大的反應截面σ值(254 000 b,1 b=10-28m2)，在和中子發生俘獲反應后，放出1 330 keV高能γ射線和低能電子。157Gd的高能γ射線輻射范圍較廣，穿透力強，可損傷腫瘤細胞，抑制腫瘤生長[2-3]。然而，由于釓發射的二次粒子譜的復雜性，包括瞬發γ射線、內轉換電子、X射線和俄歇電子，限制了這種治療[4]的選擇性。近年來，人們通過對釓攜帶劑不同的修飾來提高GdNCT[5]的靶向性。

1 GdNCT原理

放射療法主要利用電離輻射產生的生物效應，使腫瘤細胞膜上的蛋白質等大分子物質變性失活，造成細胞凋亡壞死。細胞死亡后釋放的抗原又可以激發機體免疫反應，起到類似原位腫瘤疫苗的效果[6]，而其中內照射療法則是將放射源引入體內，盡可能進入腫瘤內或者貼近腫瘤，有效地殺死腫瘤細胞。

GdNCT作為新型內照射療法的一種，不僅有著非常強的放射生物學效應(relative biologi-cal effectiveness, RBE)，還有著高于傳統放射療法的靶向性。Gd元素有七種穩定同位素，包括152Gd(0.205%)、154Gd(2.23%) 、155Gd(15.10%)、156Gd(20.60%)、157Gd(15.70%)、158Gd(24.50%)和160Gd(21.60%)[6]。在這些核素中，157Gd和155Gd具有最大的中子反應截面，分別為25.4萬巴和6.08萬巴，是硼(10B)的66倍和16倍。Gd在俘獲中子反應后的作用產物分別是高能γ射線、內轉換(internal conversion, IC)電子、X射線和俄歇電子。γ射線和IC電子的平均能量分別約為1 330 keV和66.5 keV，它們的路徑長度分別是幾厘米和幾毫米。俄歇電子是高傳能線密度(linear energy transfer, LET)的低能電子，它在水溶液中的路徑長度只有幾個納米，其RBE效應與γ射線相比，俄歇電子引起的脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)損傷是其5～10倍。但是以157Gd為例，由于俄歇電子電離輻射局限于分子尺寸，即5～40 nm，所以為了提高GdNCT對DNA的破壞性，在腫瘤細胞中，157Gd必須盡可能靠近細胞核。具體反應過程如圖1所示[7]。

圖1 157Gd的中子俘獲反應示意圖[7]Fig.1 Schematic diagram of neutron capture reaction of 157Gd[7]

2 GdNCT優勢和局限性

為了進行準確的治療，許多醫學成像方法如計算機斷層成像(computer tomography, CT)、正電子發射斷層顯像(polyethylene terephthalate, PET)[8]、熒光成像(fluorescence imag-ine, FI)[9]、核磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)[10]和光聲成像(photoacoustic imaging, PAI)均被應用于聯合治療。特別是MRI，由于其深穿透性、無侵襲性、無電離輻射累積及軟組織高分辨率，是目前臨床廣泛應用的診斷技術。

為了進行準確的治療，許多醫學成像方法如計算機斷層成像(computer tomography, CT)、正電子發射斷層顯像(polyethylene terephthalate, PET)[8]、熒光成像(fluorescence imag-ine, FI)[9]、核磁共振成像(magnetic resonanceimaging, MRI)[10]和光聲成像(photoacoustic imaging, PAI)均被應用于聯合治療。特別是MRI，由于其深穿透性、無侵襲性、無電離輻射累積及軟組織高分辨率，是目前臨床廣泛應用的診斷技術。

在MRI掃描過程中，掃描儀會發射出一個射頻(radio frequency, RF)脈沖，導致一些元素比如氫質子發生激勵而產生磁共振現象。弛豫是自旋釋放從射頻脈沖接收到能量的過程。這一過程所需的時間就是弛豫時間，弛豫時間分為自旋-晶格弛豫時間又稱為縱向弛豫時間(T1)，另一種是自旋-自旋弛豫時間又稱為橫向弛豫時間(T2)，它們的值在很大程度上取決于化學環境和原子核。

Gd在所有元素中具有最大的純自旋磁矩，使其在醫學成像上有著突出的物理性質。Gd(Ⅲ)螯合物是T1最常見的臨床MRI對比劑[2,10]。與其他T1對比劑相比，Gd螯合劑可以通過降低T1在組織中的弛豫常數來提高信噪比(signal noise ratio, SNR)，即Gd螯合劑縮短了氫質子的縱向弛豫時間，從而獲得了明顯的成像對比效果。

盡管Gd在醫學成像中具有突出的物理性質，但Gd基對比劑(gadolinium based contrast agency, GBCA)在腦內沉積和滯留，在臨床應用中帶來了關鍵的安全問題。此外，γ射線的放射生物學效應(relative biological effectiveness, RBE)與硼中子俘獲治療(BNCT)產生的α粒子的RBE相比不足，是GdNCT的另一個不可改變的缺點。在過去的幾十年里，人們在如何提高釓釋放劑的選擇性和降低其毒性這一領域做出了許多努力。

3 早期釓攜帶劑的發展

使用Gd螯合物作為NCT治療的最早報道，與商用MRI對比劑有關。Brugger研究組[11]第一個報道了Gd螯合物作為NCT釓攜帶劑應用。采用釓-二乙基三胺五乙酸(gadolinium diethylenetriaminepentaacetic acid, Gd-DTPA)和釓-1，4，7四氮雜環十二烷-1，4，7，10-四羧基(Gd-1,4,7,10-tetraazacyclododecane-N,N′,N,N′-tetraacetic acid, Gd-DOTA)(圖2)通過靜脈注射治療小鼠腦腫瘤。實驗證明，這些Gd攜帶劑可明顯濃聚在腦腫瘤組織，達到每克腫瘤組織含Gd 300 μg。使用Gd-乙二胺四雙亞甲基膦(gadoterate ethylenediaminetetramethylene phosphonic acid, Gd-EDTMP)可將此濃度提高至800 μg，并且腫瘤組織與正常組織在Gd的攝取量上顯示極大的差別。對于含釓螯合物Gd-DTPA另一種相關動物實驗使用的是大鼠延森肉瘤模型[12]。大鼠瘤內注射Gd-DTPA后，瘤內Gd的質量分數約為13 750×10-6，中子照射治療后對腫瘤的殺傷效果顯著增強(腫瘤生長下降至腫瘤完全消退約80%)。神田公司[12]在一份簡短的通訊中也報道了在新西蘭大白兔左股動脈分支連續注射Gd-DTPA的實驗結果，雖然Gd含量在腫瘤和其相鄰正常組織間的分布沒有差異，但是與對照組相比，注射含Gd藥物后的腫瘤在治療后第16—23 d內生長明顯受到抑制。最近，Hosmane等[13]觀察到9L腦瘤大鼠靜脈注射Gd-DTPA后，實驗組平均生存(33.5±3.0) d，而對照組平均生存(16.4±0.6) d，GdNCT后的大鼠存活時間顯著延長。

圖2 簡單157Gd螯合物的化學結構示意圖[11]Fig.2 Chemical structures of gadolinium-based chelate complexes[11]

Gd-BOPTA(圖3)是另一種臨床使用的Gd MRI對比劑[14-15]，實驗采用四組大鼠腫瘤模型，分別注射相同劑量的Gd-BOPTA和Gd-DTPA。中子照射治療后，明顯發現Gd-BOPTA組的腫瘤生長緩慢。Gd-BOPTA的治療效果強于Gd-DTPA的原因可能是：腫瘤對Gd-BOPTA選擇性攝取量更高；Gd-BOPTA與白蛋白的結合力較弱，增加了Gd在腫瘤中的滯留；所以Gd-BOPTA在當時被認為是一種較有效的釓攜帶劑。

圖3 Gd-BOPTA化學結構示意圖[14]Fig.3 Chemical structures of Gd-BOPTA[14]

2010年，Rendina課題組[16]報道了第一個通過鉑配合物將Gd接近腫瘤細胞核的例子。他們提出了一種新的Pt-Gd復合物(圖4)，通過功能化DTPA配體連接，可以有效地靶向腫瘤細胞的細胞核并以插入方式結合DNA。他們認為，因為PtDTPA較高的腫瘤細胞攝取率，從而使結合的Gd盡可能地接近腫瘤細胞DNA以充分利用GdNCT產生的俄歇電子RBE效應[12]。

圖4 連接兩個{PtⅡ (terpy)}(terpy=2,2′∶6′，2′-terpyridine) PtDTPA功能化的Pt-Gd復合物的化學結構[16]Fig.4 Chemical structure of the functionalized gadopentetate dimeglumine ligand linked to two {PtⅡ (terpy)} (terpy=2,2′∶6′,2′-terpyridine) PtDTPA[16]

4 釓攜帶劑研究現狀

為提高腫瘤對釓攜帶劑的攝取率，現有通過構建葉酸受體[5]適配體、具有核穿透性的RGD(GRGDNP, RGD)肽[17]和腫瘤微環境(tumor microenvironment, TME)響應結構等提高其靶向性[2]；通過脂質體包裹的釓化合物也被用來延長其在體內的循環時間[18-19]。此外，其他材料如低密度脂蛋白[20]、殼聚糖[21]、碳基納米結構[22]和聚合物基結構[23]已被應用于增強GdNCT的治療效果。

4.1 釓-硼中子俘獲治療

將硼中子俘獲治療(BNCT)與釓中子俘獲治療(GdNCT)相結合形成新的釓-硼中子俘獲治療(GdBNCT)方法顯然可以彌補上述釓攜帶劑不足。兩種不同的二次輻射模式的整合可以帶來特殊的治療效果。有兩種可能的策略：第一種策略是同時使用兩種NCT攜帶劑，一種攜帶10B，另一種攜帶157Gd；第二種策略是開發同時含有10B和157Gd化合物的中子俘獲治療藥物。Crich課題組[24]開發了一種基于聚(乳酸-co-乙醇酸)(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)和硼化姜黃素(boronated curcumin，圖5)的治療平臺。

圖5 葉酸偶聯PLGA RbCur/Gd納米顆粒(PLGA-NP-Folate)示意圖[24]Fig.5 Schematic representation of folate conjugated PLGA RbCur/Gd nanoparticles(PLGA-NP-Folate)[24]

如體外實驗所示，觀察到該聯合方法明顯改善了腫瘤的治療效果。與臨床使用的硼攜帶劑硼苯丙氨酸(L-para-boronophenylalanine, BPA)相比，其腫瘤硼濃度含量更高(圖6)[24]。對于第一個策略，Icten等[25]利用硼酸釓(gadolinium boron oxide, GdBO3)和Fe3O4的生物偶聯來實現GdBNCT的治療。其以Fe3O4、硼砂或硼酸和三價釓鹽為原料，水熱法制備納米復合材料，然后用檸檬酸和異硫氰酸熒光素摻雜的二氧化硅進行生物偶聯，最后用葉酸處理。其10B和157Gd的含量分別約為每微克1.8×1014和1.2×1014個原子。并且在HeLa和A549細胞上通過熒光顯微鏡和細胞流式儀，都證明了葉酸作為靶點的優秀靶向性。各項實驗結果都證明GdBO3和Fe3O4生物偶聯物是可用于靶向治療、熒光成像和核磁共振成像的藥物。

■——PLGA-NP-Ctrl，●——PLGA-NP-Folate，▲——BPA圖6 在37 ℃下增加BPA濃度(10～500 μmol/L硼)孵育3 h或PLGA-NP-Ctrl或PLGA-NP-Folate(28～220 μmol/L硼)孵育6 h時IGROV-1細胞中的硼內化情況[24]Fig.6 Boron internalization in IGROV-1 cells on incubation in the presence of increasing BPA concentrations (10-500 μmol/L boron) for 3 h at 37 ℃ or with PLGA-NP-Ctrl or PLGA-NP-Folate(28-220 μmol/L boron) for 6 h at 37 ℃[24]

4.2 釓藥物的多種構型

脂質體因其生物相容性、長循環特性和穩定體內載物的能力，在藥物輸送系統中具有重要意義。脂質體包裹的釓攜帶劑可以克服釓螯合物遞送的各種困難，并獲得更好的治療結果。Langguth課題組[26]研究了脂質體Gd-DTPA的抗腫瘤療效；脂質體大小約為136～152 nm，這樣的尺寸避免了Gd-DTPA的過早釋放；1 h后，大約50%的Gd-DTPA仍包裹在脂質體中。Ramaldes課題組[19]開發了具有放射性標記的159Gd-DTPA-BMA的脂質體(圖7)，他們發現該脂質體的細胞毒性大約是游離的Gd-DTPA-BMA的1 170倍。

圖7 脂質體樣品中159Gd的γ譜[19]Fig.7 Gamma spectrum of 159Gd in liposome sample[19]

Fukumori課題組[21]利用戊二醛作為交聯劑，通過乳液法制備了高水溶性Gd-DTPA殼聚糖微球(CMS-Gd-DTPA)，用于中子俘獲治療。紅外光譜表明，殼聚糖與Gd-DTPA之間的靜電相互作用加速了富釓殼聚糖微球的形成。CMS-Gd-DTPA中位直徑為11.7 μm，含有11.6%(質量分數)的釓，可在瘤內注射后用于GdNCT。與單獨Gd-DTPA相比，CMS-Gd-DTPA的釓體外釋放明顯延遲(圖8)。

圖8 CMS-Gd-DTPA和10 mL GST交聯后的Gd體外釋放實驗(37 ℃，磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH=7.4)，Gd質量分數11.6%，平均粒徑11.7 μm)[21]Fig.8 In vitro release profile of gadolinium from CMS-Gd-DTPA cross-linked with 10 mL GST having 11.6% of gadolinium and 11.7 μm of the mass median diameter in isotonic phosphate buffer solution(pH=7.4) at 37 ℃[21]

金屬富勒烯籠中含有一個或多個金屬原子，是一類具有不同尋常的電子和磁性的新型材料。長崎課題組[22]發現構建Gd@C82可以像溶解C60等富勒烯一樣，加入PEG-b-PAMA使其易溶于水，形成一個透明、復雜的直徑約20～30 nm的軛合物(圖9)。中子輻照用Gd@C82-PEG-b-PAMA納米顆粒孵育colon-26腺癌細胞后，該腫瘤細胞絕大部分被殺死，并且本研究中的含Gd納米粒子(GdNPs)在細胞毒性實驗中，細胞存活率與對照組相比沒有差別，比以前報道的釓攜帶劑毒性要小得多[23]。

圖9 GdNPs制備工藝示意圖[22]Fig.9 Schematic of the preparation process of GdNPs[22]

4.3 刺激響應型藥物遞送

磷酸鈣(calcium phosphate tribasic, CaP)納米顆粒作為人類骨骼和牙齒的無機礦物，具有較高的生物相容性和良好的生物降解性，因此其在醫療領域的應用越來越受到關注。它不容易被微生物降解，但是在pH=7.4時可適度溶解，在pH≤6可逐漸溶解，所以CaP納米顆粒在遞送到細胞時仍可保持完整，而細胞進入內溶酶體后由于pH降低所以迅速溶解，這使得它在藥物遞送方面具有極大的潛力。Kataoka課題組[27]構建了磷酸鈣膠束與聚陰離子嵌段共聚物雜交，并與臨床MRI對比劑Gd-DTPA/CaP相結合(圖10)。細胞毒性實驗中Gd-DTPA/CaP在100 μmol/L下對癌細胞無毒，而在此濃度下，超過50%的癌細胞在熱中子照射后被殺死。此外，由于Gd-DTPA/CaP在腫瘤中的攝取量顯著增加，因此可通過MRI來精確定位腫瘤位置(圖11)。

圖10 Gd-DTPA/CaP復合膠束靶向腫瘤GdNCT方案[27]Fig.10 Scheme of Gd-DTPA/CaP hybrid micelles targeting tumors for GdNCT[27]

○——Gd-DTPA/CaP+熱中子照射，□——Gd-DTPA+熱中子照射，△——Gd-DTPA/CaP，×——Gd-DTPA圖11 Gd-DTPA/CaP在體內MR成像引導下的中子俘獲治療[27]Fig.11 In vivo MR imaging-guided neutron capture therapy with Gd-DTPA/CaP[27]

4.4 活性導向性藥物

環狀RGDs(cRGDs)是一種含有一系列精氨酸(Arg)-甘氨酸(Gly)-天冬氨酸(Asp)作為環狀成分的三肽，它通過結合αvβ3和αvβ5整合素來靶向腫瘤，這些整合素在腫瘤血管生成位點并在腫瘤細胞中過表達。RGDs之所以吸引人是因為它們比抗體小，容易通過化學方法大規模合成，具有低毒性和低免疫原性，可以很容易地偶聯到納米系統上達到成像和治療的目的。Lee課題組[17]用環狀RGDs作為腫瘤靶向配體，包覆超微氧化釓納米顆粒(GNPs，粒徑為1.0～2.5 nm)(圖12)。涂層中使用了五種商用cRGD。通過一鍋法合成了cRGD包覆的GNPs (cRGD-GNPs)。它們的縱向水質子弛豫度r1值為10.0～18.7/(s·mmol/L),r2/r1值為1.4～1.7(r2為橫向水質子弛豫度)，是Gd螯合物的3～5倍。使用制備五種cRGD-GNPs樣品溶液中的一種，在肝臟腫瘤模型小鼠上進行T1MRI成像，證實了cRGD-GNPs的腫瘤靶向性[17]。靜脈注射該溶液后對感興趣區域(region of interested, ROI)的信噪比(SNR)進行研究，如圖13，T1MRI圖像中觀察到肝臟腫瘤區攝取量約是正常部位的3倍。這些結果表明，cRGD-GNPs是潛在的具有腫瘤靶向性的診療一體化藥物。

圖12 cRGD1-GNP表面包被結構[17]Fig.12 Surface-coating structure of the cRGD1-GNP[17]

Pre代表靜脈注射后成像圖13 肝臟正常部分、腫瘤部分、壞死部分ROI的信噪比隨時間變化圖[17]Fig.13 Plots of SNRs of ROIs in the normal part, the tumor part, and the necrotic part of the liver as a function of time[17]

5 結 論

Gd在NCT中的應用因其具有較高的中子截面和良好的MRI成像而倍受關注。雖然GdNCT早在多年前就被提出，但由于缺乏具有較高腫瘤選擇性的釓攜帶劑，使GdNCT發展滯后。為了充分利用俄歇電子的RBE效應，需要合成能夠盡可能靠近細胞DNA的新型釓攜帶劑。現有釓攜帶劑的報道也為我們解決GdNCT問題提供一些發展思路，例如使用靶向性載體，可以大大提高腫瘤對釓攜帶劑的攝取，延長其滯留時間；利用釓的治療特性，通過測量局部Gd濃度來優化中子輻照時間和傳遞的輻射劑量；可以聯合應用BNCT和GdNCT，這樣可避免腫瘤復發的幾率，提高治療腫瘤的效果。