基于網絡藥理學和分子對接分析續斷-桑寄生改善多囊卵巢綜合征的作用機制

韓聰，夏銘鴻，胡淵龍，張建偉

(1.山東中醫藥大學 第一臨床醫學院，山東 濟南 250011;2. 浙江大學 醫學院，浙江 杭州 310000; 3.山東中醫藥大學附屬醫院 中西醫結合生殖與遺傳中心，山東 濟南 250011)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)為育齡期女性常見內分泌紊亂疾病，特征表現為高雄激素及排卵障礙，常伴發月經失調、不孕、肥胖等多種臨床癥狀，對生育期女性健康影響主要表現在生育力的降低、妊娠期并發癥及新生兒不良結局等[1]。PCOS病因尚未明確，但癥狀和體征上的異質性提示其非單一因素引起[2]。治療多采用個體化治療方案，西醫主要通過避孕藥、促排卵藥物等控制和緩解高雄激素血癥的臨床癥狀和預防不孕等，但用藥需謹慎，長期用藥或可導致不良疾病風險增加，如心血管疾病等[3]；中醫診療強調整體觀念，從整體調整氣血陰陽，在治療PCOS方面確有優勢[4]。續斷-桑寄生藥對在臨床常用于治療PCOS，桑寄生功長補肝腎、強筋骨、祛風濕、安胎；續斷功善補肝腎、強筋骨、續折傷；二者合用更增補益肝腎之功，且有調任固沖之效。中醫學者多主張PCOS病因病機為肝脾腎三臟功能失常，沖任不能相資，故治療多以補腎益陰，調沖任為主。曾蕾等[5]在分析、探討羅氏婦科治療PCOS的中藥周期序貫療法規律中發現，腎虛痰濕型PCOS患者基礎體溫雙相波動的聯合用藥中，續斷-桑寄生藥對使用頻率最高。肖承悰教授以續斷-桑寄生為核心藥對配伍治療PCOS，總治療有效率為95.31%[6]。但是，目前續斷-桑寄生藥對改善PCOS的作用機制尚不清晰。

網絡藥理學是一種借助網絡數據庫及計算機智能計算，建立藥物成分、靶點與疾病間關系網絡，探析藥物對疾病作用機制的新生物信息學方法[7]。中醫學以整體觀和辨證論治為基本特點的理論體系，與網絡藥理學整體性和系統性的特色相契合。現已有研究通過網絡藥理學，揭示了當歸-菟絲子藥對[8]、半夏-蒼術-香附藥對[9]等治療多囊卵巢綜合征的作用機制，故本研究嘗試借助網絡藥理學，系統地分析續斷-桑寄生藥對改善PCOS的作用機制。

1 材料與方法

1.1 續斷-桑寄生藥對活性成分篩選和靶點預測

登陸中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php，update by May 31th，2014，v2.3)，選擇 Herb name，依次輸入“Xuduan”“Sangjisheng”為關鍵詞搜索續斷、桑寄生的化學成分；選擇口服生物利用度(oral bioavailability，OB)及類藥性(drug-likeness，DL)為篩選條件，因桑寄生活性成分較少，DL≥0.05條件下生物利用度均良好，故篩選OB≥30%及DL≥0.05的藥對活性成分，去重后得到主要活性成分。同時，提取其蛋白質靶點，最終整理得到續斷與桑寄生的活性成分及其對應靶標。

1.2 多囊卵巢綜合征疾病靶點收集

選擇Disgenet數據庫(https://www.disgenet.org)以及OMIM數據庫(https://omim.org)，對關鍵詞為“Polycystic ovaries”或“Polycystic Ovary Syndrome”疾病的相關靶點進行檢索及篩選，并對所得結果進行合并去重獲得PCOS疾病靶點信息。

1.3 中藥-活性成分-疾病靶點網絡的構建與分析

為探討續斷-桑寄生藥對活性成分靶點與PCOS疾病靶點之間的關系，利用在線作圖工具微生信平臺(http：//www.bioinformatics.com.cn/)繪制維恩圖，獲得續斷-桑寄生藥對活性成分靶點與PCOS疾病靶點的交集基因。運用Cytoscape 3.7.0軟件繪制中藥-活性成分-疾病靶點的網絡圖。

1.4 交集基因蛋白質-蛋白質相互作用

采用STRING數據庫(https://string-db.org)構建蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction， PPI)網絡圖，設定生物種類為“Homo sapiens”，最小相互作用閾值Highest confidence>0.9為篩選條件。

1.5 富集分析

為進一步探索續斷-桑寄生藥對治療PCOS潛在靶點在信號通路中的作用，將交集基因導入Metascape(https://metascape.org/)進行京都基因和基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and gnomes， KEGG)通路及基因本體(gene ontology，GO)富集分析，依據所得結果分析預測續斷-桑寄生藥對治療PCOS的可能機制。將通路P值由小到大排序，并進行可視化展示。

1.6 成分-靶點-關鍵通路網絡的構建

為進一步呈現續斷-桑寄生藥對與PCOS作用的復雜網絡關系，以count值為篩選條件，得到前10條關鍵通路，與續斷-桑寄生藥對的活性成分及潛在靶點相映射，并利用Cytoscape軟件繪制活性成分-靶點-關鍵通路網絡，探究該藥對改善PCOS的潛在作用機制。

1.7 主要活性成分與靶點的分子對接驗證

在PDB數據庫(http://www.rcsb.org/)檢索并下載核心靶點的3D蛋白結構，導入Autodock Tools 1.5.6軟件進行預處理，通過TCMSP數據庫下載主要活性成分的結構，將處理后的蛋白與分子輸入AutoDock Vina進行分子對接驗證，借助Pymol進行可視化分析。

2 結果

2.1 活性成分篩選及靶點篩選

篩選出續斷-桑寄生藥對的活性化合物共13個(續斷8個，桑寄生6個，桑寄生和續斷共有1個)，并對篩選得到潛在靶點的活性化合物進行編號，見表1。對 TCMSP 所得的252個潛在靶點(其中有4個化合物未查詢到潛在靶點信息)進行去重后整理獲得174個靶點。

2.2 疾病靶點篩選結果

對所得結果合并及去重后共獲得1 606個PCOS相關疾病靶點。

2.3 中藥-活性成分-疾病靶點網絡構建與結果分析

共獲得交集基因80個，維恩圖見圖1。通過Cytoscape 軟件得到中藥-活性成分-疾病靶點網絡見圖2。分析圖2可得，186個網絡節點中藥物節點2個，活性成分節點10個，靶點節點174個，成分與靶點之間邊239條；靶點數前7位的成分為槲皮素(quercetin，桑寄生)、β-谷甾醇(beta-sitosterol，續斷)、龍膽黃素(gentisin，續斷)、(z)-石竹烯((z)-caryophyllene，桑寄生)、谷甾醇(sitosterol，續斷)、林生續斷苷Ⅲ(sylvestroside III，續斷)、當藥糖苷(sweroside aglycone,續斷)、威巖仙皂苷A(cauloside A，續斷)，這些成分可能為續斷-桑寄生藥對治療PCOS的關鍵成分。

圖1 活性成分與疾病靶點的維恩圖Fig.1 Venn diagram of active ingredients and disease targets

注：XD為續斷，SJS為桑寄生。圖2 中藥-活性成分-疾病靶點網絡Fig.2 TCM-active ingredient-disease target network

2.4 交集靶點PPI網絡分析

續斷-桑寄生藥對活性成分靶點與PCOS靶點交集的PPI網絡圖見圖3。分析圖3可知，該網絡含有80個節點與233條邊，平均節點度值是5.83，平均介數值是0.469。續斷-桑寄生藥對可能通過相關靶點AKT1、CASP3、MAPK1、FOS等發揮治療PCOS的作用。

圖3 活性成分與疾病靶點交集的PPI網絡圖Fig.3 Protein-protein interaction network of the active ingredients and disease targets

2.5 KEGG與GO富集分析

導入交集基因至Metascape數據庫中進行KEGG分析，獲得KEGG條目168個(P<0.001)，主要涉及癌癥信號通路、切變應激和血管粥樣硬化信號通路、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、丙型肝炎信號通路以及胰島素抵抗信號通路等，詳見圖4。GO分析共得到生物學功能94個、生物過程1 722個、細胞組分53個，主要涉及細胞因子受體結合、RNA聚合酶II轉錄因子結合、蛋白結構域特異性結合、蛋白酶結合泛素樣、蛋白連接酶結合等生物學功能,與凋亡信號通路、對損傷活性氧代謝過程、血管發育反應過程、對脂多糖的反應、對有毒物質的反應等生物學過程密切相關，過程涉及膜筏、細胞外間質、核被膜等細胞組分。其中生物學功能、生物過程、細胞組分富集基因數排序前10位的GO分析結果見表2～4。

圖4 KEGG通路富集分析Fig.4 KEGG pathway enrichment analysis

表2 續斷-桑寄生治療PCOS涉及的主要生物學功能

表3 續斷-桑寄生治療PCOS涉及的主要生物學過程Table 3 The main biological processes involved in the treatment of PCOS using Dipsaci Radix-Taxilli Herba

表4 續斷-桑寄生治療多囊卵巢綜合征涉及的主要細胞組分Table 4 The main cellular components involved in the treatment of PCOS using Dipsaci Radix-Taxilli Herba

2.6 成分-靶點-關鍵通路網絡的結果分析

繪制關鍵通路與續斷-桑寄生藥對的活性成分及交集潛在作用靶點的成分-靶點-通路網絡，詳見圖5。分析圖5可知，續斷-桑寄生藥對可能通過多個活性成分、靶點及通路對PCOS發揮治療作用。其中，重要的成分有桑寄生中的槲皮素，續斷中的β-谷甾醇等，主要靶點有AKT1、MAPK1、TNF、IL-6、CASP3等，其中核心靶點為AKT1，通路主要涉及癌癥信號通路(pathways in cancer)、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、丙型肝炎信號通路(Hepatitis C)、IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、HIF-1信號通路(HIF-1 signaling pathway)以及胰島素抵抗信號通路(insulin resistance pathway)等。

圖5 成分-靶點-關鍵通路網絡Fig.5 Ingredient-target-key pathway network

2.7 分子對接驗證

對 PPI所得預測結果中的核心靶點AKT1分別與續斷、桑寄生的主要活性成分槲皮素、林生續斷苷Ⅲ進行分子對接驗證，見圖6。Autodock Vina分析其結合能分別為-13.81、-34.32 kJ/mol，認為AKT1與槲皮素、林生續斷苷Ⅲ有效結合，預測結果可靠。

圖6 主要活性化合物與AKT1的分子對接圖Fig.6 Molecular docking diagram of active compounds and AKT1

3 討論

桑寄生-續斷是治療PCOS的常用藥對，具有補肝腎、益血安胎、調理沖任的功效，為壽胎丸、育陰湯、桑寄生散等方的重要藥對。同時，二者共用有補而不滯、 行而不泄的優點[10]。多囊卵巢綜合征在中醫學中并無明確記載，古籍中記載的“惟彼肥碩者……痰涎壅滯……故有過期而經始行，或數月經一行，及為濁，為帶，為經閉，為無子之病”[11]，據其臨床表現特點，應隸屬于中醫學“月經后期”“崩漏”“閉經”“不孕”等疾病范疇。

目前，PCOS的病因并未明確，西醫認為PCOS的發生與胰島素抵抗、高雄激素血癥密切相關，與慢性炎癥可能有關。治療可通過增加胰島素受體的敏感性、抗雄激素作用、下調亞臨床慢性炎癥因子等來延緩PCOS的發生與發展。有研究表明，PCOS患者血清中C反應蛋白及白細胞介素-6( interleukin，IL-6)等炎癥因子水平與雄激素水平及胰島素抵抗呈正相關[12-13]，呈慢性低度亞臨床炎癥表現。PCOS患者體內炎癥因子水平與腫瘤壞死因子-α( tumor necrosis factor-α，TNF-α) 等炎癥因子水平呈相關性[14]。

3.1 續斷-桑寄生治療PCOS 的主要活性成分

本研究在網絡藥理學篩選及預測的基礎上，整理得到續斷-桑寄生174個活性成分，通過富集分析發現桑寄生中的槲皮素，共有成分β-谷甾醇及續斷中的威巖仙皂苷A、龍膽黃素、林生續斷苷Ⅲ在治療PCOS中占有重要地位。槲皮素為黃酮類化合物，為桑寄生主要化學成分，已有研究表明槲皮素是減輕PCOS并發癥的潛在藥物[15]。臨床實驗證實，槲皮素可通過降低PCOS婦女胰島素抵抗、雄激素及促黃體生成素水平,上調AMPK和脂聯素受體的表達[16-18]改善 PCOS患者的代謝紊亂狀態。形成高脂血癥的主要因素為低密度脂蛋白膽固醇[19]，已有臨床實驗表明，β-谷甾醇可顯著降低血清總膽固醇及低密度脂蛋白水平[20]，其降低血脂的效果優于安妥明[21]。并且β-谷甾醇可通過增加機體免疫力[22]、誘導腫瘤細胞的凋亡[23]以及遏制腫瘤細胞增殖[24]等途徑，發揮減輕患者炎癥反應的作用。續斷主要包含三萜皂苷類、環烯醚萜類化合物，以及生物堿等其他成分。威巖仙皂苷A為三萜皂苷類活性成分，三萜皂苷類可通過激活孕激素受體，誘導蛻膜化，為受精卵提供良好的植入條件[25]。龍膽黃素屬生物堿成分，已有實驗證實生物堿可抑制子宮平滑肌的收縮活動，降低催產素誘導的子宮收縮力與張力[26]，從而提高女性生育力。

3.2 續斷-桑寄生治療PCOS 的主要作用靶點

本研究篩選整理得到的主要作用靶點有AKT1、MAPK1、TNF-α和IL-6，在胰島素信號傳導中有重要影響。AKT可影響雄激素水平，從而可以提高胰島素敏感性[27]。有動物實驗證明二甲雙胍通過調控AKT信號傳導途徑改善胰島素抵抗[28]，而槲皮素也可通過調控AKT來改善糖代謝[29]。炎癥信號的慢行激活被認為是胰島素抵抗的原因之一[30]。有研究發現槲皮素通過調節白細胞介素-1β、IL-6和TNF-α水平來改善炎癥微環境從而降低PCOS大鼠模型中的胰島素抵抗[31]。IL-6是免疫應答反應中重要細胞因子，可協同TNF-α，增加胰島素抵抗水平[32]，從而導致PCOS的進一步加重[33]。動物實驗表明，IL-6等炎癥細胞因子可能通過胰島素抵抗，引起高胰島素血癥的代償發生，從而導致PCOS[34]。同時，實驗發現降低TNF-α、IL-6水平可減輕胰島素抵抗，通過調節內分泌及生殖軸，推動卵泡發育成熟及誘發排卵[35]。

3.3 續斷-桑寄生藥對治療PCOS 的可能作用機制

基于KEGG及PPI網絡分析，預測續斷-桑寄生治療PCOS 的作用機制可能主要涉及癌癥信號通路、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、丙型肝炎信號通路、IL-17信號通路、HIF-1信號通路、胰島素抵抗信號通路等。PCOS患者子宮內膜癌、結腸癌的發病率呈數倍增高，本研究預測的癌癥信號通路是否與之相關，還需進一步挖掘。PCOS婦女體內促黃體生成素水平升高，促卵泡生成素水平不變或降低，繼而引起雄激素分泌增高,誘發高雄激素血癥，從而抑制排卵的發生，導致不孕的伴發；TNF-α能抑制促卵泡生成素的分泌[36]，進而加重PCOS。槲皮素降低促黃體生成素水平，抑制TNF-α的作用，推測可能與炎癥信號通路有關。HIF-1是細胞缺氧耐受相關轉錄因子，是排卵過程中的關鍵因子，研究表明，胰島素可誘導卵巢顆粒細胞激活HIF-1信號通路，該通路對PCOS卵巢功能具有調控作用[37]。PCOS患者主要表現為內分泌代謝紊亂，常伴發肥胖、胰島素抵抗、糖尿病、脂代謝紊亂等多種代謝異常疾病。臨床治療中，胰島素增敏劑能有效減緩胰島素抵抗發生與發展，改善糖代謝，并且可防止多系統并發癥的發生。由此推測，續斷-桑寄生藥對治療PCOS主要通過改善激素代謝、抗炎、抗癌等機制發揮作用。

4 結語

本研究基于網絡藥理學分析了續斷-桑寄生藥對改善PCOS 的作用機制，推測續斷-桑寄生藥對可能通過調節炎癥微環境、改善激素代謝從而調理內分泌代謝紊亂，進而達到緩解PCOS發生發展的目的，可為后期進一步探究續斷-桑寄生藥對治療PCOS 的實驗研究及臨床應用提供理論依據。