獵蝽科昆蟲線粒體基因組的比較研究

趙婉清 李巧 李瑩 楊柳 鄭茜之 張虎芳

摘要：線粒體基因組是系統發育常用的分子標記，本研究旨在對獵蝽科昆蟲的線粒體基因組進行比較研究，著重分析基因重排、堿基組成、密碼子使用偏好性等特征，并構建基于13個蛋白編碼基因的系統發育關系。在GenBank數據庫下載獵蝽科11亞科30屬代表物種的線粒體基因組序列，通過Geneious 8.0.4抽提各編碼基因的序列。利用MEGA 7.0統計堿基組成、氨基酸和核苷酸序列信息位點、起始密碼子、終止密碼子、相對密碼子使用頻率（RSCU）等序列基本信息。另外，利用DnaSP 6.0計算蛋白編碼基因的非同義替換率（Ka）和同義替換率（Ks），并通過Ka/Ks值比較基因的核苷酸進化速率。通過jModelTest選擇進化模型，在MrBayes 3.2.2軟件中構建基于貝葉斯法（BI）的系統發育樹。結果表明：獵蝽科線粒體基因組均呈共線性結構，沒有發現大面積的基因重排現象，只有部分序列中rrnS和trnT基因編碼方向與原始序列編碼方向相反，trnR和cytb基因出現多拷貝的現象。獵蝽科線粒體最常使用ATN起始密碼子和TAA終止密碼子。BI系統發育樹對獵蝽科各亞科之間的關系進行了一定的解析，光獵蝽亞科（Ectrichodiinae）和獵蝽亞科（Reduviinae）為并系群，真獵蝽亞科（Harpactorinae）和錐獵蝽亞科（Triatominae）為單系群。本研究為獵蝽科昆蟲的線粒體基因組進行了比較分析，為后續研究該科系統發生關系奠定了科學基礎。

關鍵詞：獵蝽科;線粒體基因組;比較基因組學;系統發育;分子標記;基因重排;堿基組成;密碼子使用偏好性

中圖分類號： S433.3文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）12-0034-08

收稿日期：2021-11-23

基金項目：山西省高等學校科技創新項目（編號：2019L09841）;忻州師范學院院級科研基金（編號：2018KY04）。

作者簡介：趙婉清（1989—），女，山西靈石人，博士，主要從事昆蟲分子系統學研究。E-mail：zhaowanqing@vip.163.com。

通信作者：張虎芳，博士，教授，主要從事昆蟲分子系統學研究。E-mail：zh_hufang@sohu.com。

線粒體具有獨立的基因組，且在真核生物細胞內廣泛存在。線粒體基因組結構簡單、排列緊密、進化速率較快、能夠獨立復制、編輯效率高，是系統發育進化、種群遺傳學、生物地理學等常用的標記基因[1-3]。隨著生物測序技術的迅速發展，GenBank數據庫中的昆蟲線粒體基因組序列越來越多，為昆蟲線粒體的比較分析以及分子系統學研究提供了新的方向和依據。昆蟲線粒體基因組一般包括37個編碼基因（13個蛋白編碼基因、22個tRNA基因和2個rRNA基因）和一段控制區[4]。對近緣物種進行比較線粒體基因組學研究可以為物種的分類和系統發育關系奠定理論依據。

獵蝽科（Reduviidae）隸屬于半翅目（Hemiptera）異翅亞目（Heteroptera），廣布于世界各地，種類較多，是異翅亞目中的一個大科[5]。該科多為捕食性昆蟲，某些種類可以捕食褐飛虱、草地貪夜蛾、斜紋夜蛾、煙青蟲等害蟲，是農林業中重要的天敵昆蟲，對該科昆蟲的研究具有一定的科學和經濟意義[6-9]。獵蝽科世界已知6 000余種，我國記錄13個亞科400余種[5]。以往對獵蝽科系統發育的研究主要是基于少量分子數據，而對線粒體基因組的研究較少[10]。

本研究選取獵蝽科11亞科30屬的代表物種，進行該科線粒體基因組的比較分析和系統發育研究。對線粒體基因組的排列、堿基組成、序列信息位點、密碼子使用情況等進行比較分析，并基于貝葉斯法（Bayesian inference，BI）構建獵蝽科的系統發育關系。

1 材料與方法

1.1 序列獲取

本研究選取獵蝽科11亞科30屬的代表物種進行研究，通過NCBI中的GenBank數據庫（https//www ncbi.Nlm.nih.gov/）下載獲得線粒體序列，詳細的序列信息見表1。

1.2 數據分析

利用Geneious 8.0.4[11]軟件從線粒體基因組序列中抽提出各編碼基因，再利用SequenceMatrix[12]串聯成所需的數據集。對序列進行比對時，蛋白編碼基因需將核苷酸序列轉換為氨基酸序列，保存比對后的核苷酸序列;RNA基因直接進行比對后保存核苷酸矩陣序列。在SequenceMatrix中分別將蛋白編碼基因串聯成13個蛋白編碼基因（protein-coding genes，PCGs）、重鏈編碼的蛋白編碼基因（PCGs-J）和輕鏈編碼的蛋白編碼基因（PCGs-J）3個數據集。在MEGA 7.0[13]中統計堿基組成和序列信息位點，并計算同義密碼子相對使用頻率（RSCU）。在DnaSP 6.0[14]軟件中計算蛋白編碼基因的非同義替換率（nonsynonymous substitution rate，Ka）和同義替換率（synonymous substitution rate，Ks），進而統計每個基因的核苷酸進化速率，即Ka/Ks值。為了探究獵蝽科昆蟲的系統發育關系，選取臭蟲科1種溫帶臭蟲（Cimex lectularius）作為外群，基于13個蛋白編碼基因構建貝葉斯系統發育樹。BI發育樹在MrBayes 3.2.2[15]中運行計算，運行10 000 000代，每1 000代抽樣1次，舍去收斂前的樣本。利用jModelTest[16]預測進化模型，預測結果為GTR+I+G模型。

2 結果與分析

2.1 線粒體基因組全序列的結構

截至2021年10月，GenBank共收錄了獵蝽科11亞科30屬的昆蟲線粒體基因組序列110條，為研究該科昆蟲的比較線粒體基因組學研究奠定了良好基礎。與半翅目其他昆蟲類似，獵蝽科線粒體基因組共37個編碼基因，其中13個蛋白編碼基因、22個tRNA基因和2個rRNA基因，還包括一段非編碼控制區。線粒體基因組長度范圍為13 977～16 759 bp，最長的是伐獵蝽（Phalantus geniculatus），最短的是海南桿蝓獵蝽（Ischnobaenella hainana）。

2.2 基因重排現象

獵蝽科30屬代表物種的線粒體基因組均呈共線性結構，沒有發現大面積的基因重排現象。通過依次比較30條線粒體基因組，對個別出現重排的序列結構進行了比較作圖分析。由圖1可知，Agriosphodrus dohrni和Brontostoma colossus線粒體基因組中rrnS基因編碼方向與原始序列編碼方向相反;Dipetalogaster maximus線粒體基因組中trnT基因編碼方向與原始序列編碼方向相反;獵蝽Brontostoma colossus線粒體基因組中trnR基因有多拷貝現象，形成trnR-trnA-trnR的排列方式;Eratyrus mucronatus線粒體基因組中cytb出現多拷貝現象。

2.3 堿基組成和序列信息位點分析

已測得的獵蝽科昆蟲線粒體基因組的堿基組成具有明顯的AT偏倚性，且AT含量最高的是Polytoxus fuscovittatus（77.8%），最低的是Panstrongylus rufotuberculatus（68.1%）。對A、T、G、C各堿基的組成進行比較發現，所有獵蝽科昆蟲中堿基A的含量均高于T的含量，AT-skew均大于0（0.09～0.19）;G的含量均高于C的含量，GC-skew 均小于0（-0.27～-0.12）。

對13個蛋白編碼基因的堿基組成進行分析，結果如圖2、圖3所示。atp8的（A+T）含量最高（75.54%），cox1的（A+T）含量最低（65.75%）。位于J鏈的蛋白編碼基因（PCGs-J），（A+T）含量為69.93%，且堿基A與T的含量相同，GC-skew為-0.15。位于N鏈的蛋白編碼基因（PCGs-N），（A+T）含量為74.57%，AT-skew為-0.37，GC-skew為0.26。

13個蛋白編碼基因的核苷酸和氨基酸序列的信息位點分析結果見圖4和圖5。cox1的保守性在核苷酸和氨基酸序列中均較高（47.63%和63.98%），而atp8基因的保守性較差（14.03%和9.20%）。蛋白編碼基因的核苷酸串聯序列中，保守位點有3 624個，變異位點有7 527個，簡約信息位點有6 362個。在氨基酸串聯序列中，保守位點有387個，變異位點有3 303個，簡約信息位點有3 007個。

2.4 密碼子使用情況

在獵蝽科線粒體蛋白編碼基因中，最常使用ATN起始密碼子，但也有一些特殊情況，如nad1、nad4L和nad5也會使用GTG和TTG為起始密碼子。在ATN起始密碼子中，ATG的使用頻率較高，如atp6和nad4的起始密碼子全部為ATG（圖6）。對于終止密碼子的使用，密碼子TAA的使用頻率最高，TA的使用頻率最低。在cox1、cox2、cox3和nad5中，以T結尾的情況較多（圖7）。

本研究統計了相對密碼子使用頻率（RSCU），使用頻率較高的密碼子為UUA（L）、GUU（V）和UAU（Y），使用頻率相對較低的為CCG（P）、CUC（L）和CUG（L）（表2）。在同義密碼子中，第3位以A/U結尾的密碼子比G/C結尾的密碼子使用頻率高。

2.5 蛋白質編碼基因進化速率

蛋白編碼基因的核苷酸Ka、Ks及Ka/Ks值的統計結果見圖8。所有基因的Ka/Ks值均小于1，表明受到了純化選擇的作用。其中，atp8的進化速率最快，cox1的進化速率最慢，具體的排列順序為atp8>nad4L>nad6>nad4>nad3>nad5>atp6>cox2>nad1>nad2>cox3>cytb>cox1。

2.6 系統發育分析

以臭蟲科作為外群，基于13個蛋白編碼基因序列構建了獵蝽科30屬的BI系統發育樹（圖9）。結果表明，獵蝽科各亞科的關系得到了一定的解析，該科基部分支為盲獵蝽亞科（Saicinae），光獵蝽亞科（Ectrichodiinae）和獵蝽亞科（Reduviinae）為并系群，真獵蝽亞科（Harpactorinae）和錐獵蝽亞科（Triatominae）為單系群。錐獵蝽亞科（Triatominae）和細足獵蝽亞科（Stenopodinae）為姐妹群關系，盜獵蝽亞科（Peiratinae）和新獵蝽亞科（Centrocnemidinae）為姐妹群關系。

3 討論與結論

一直以來，果蠅（Drosophila yakuba）的線粒體基因組是公認的昆蟲線粒體基因組的原始排列方式[17]。共線性分析結果顯示，獵蝽科昆蟲線粒體基因組的排列方式比較保守，大多數與原始排列方式一致，只存在少數基因重排現象，以基因編碼方向與原始序列編碼方向相反和基因多拷貝現象為主。其中，rrnS和trnT基因的編碼方向出現與原始序列編碼方向相反的情況，trnR和cytb基因均多拷貝了1次。

獵蝽科線粒體基因組長度范圍為13 977～16 759 bp，具有明顯的AT偏倚性，A+T含量為68.1%～77.8%，且堿基A的含量均高于T，堿基G的含量均高于C。13個蛋白編碼基因中， cox1的保守性較高，而atp8基因的保守性較差。同時，采用Ka/Ks值比較基因進化速率結果也表明，atp8的進化速率最快，cox1的進化速率最慢，與先前的相關研究結果[18]一致。13個蛋白編碼基因的Ka/Ks值均小于1，可能是受到了純化選擇的作用[19]。

在密碼子的使用上，除偏好使用的ATN起始密碼子外，獵蝽科線粒體蛋白編碼基因也會以GTG和TTG作為起始密碼子。對于終止密碼子來說，除完整的TAA和TAG密碼子使用頻率較高外，不完整的TA和T在獵蝽科蛋白編碼基因中也很常見。這些不完整的終止密碼子會在轉錄形成mRNA后轉變成完整的終止密碼子[20]。同義密碼子相對使用頻率結果顯示，以A/U結尾的密碼子使用頻率高于G/C結尾的，與昆蟲線粒體基因組的高AT特性一致。

基于貝葉斯算法構建的BI系統發育樹對獵蝽科各亞科的關系進行了一定的解析，結果顯示獵蝽亞科為并系群，這與Weirauch選取162個形態特征對獵蝽科進行的支序系統學分析結果[21]，以及趙廣宇采用COI基因構建的系統發育樹結果[10]一致。本研究中真獵蝽亞科和錐獵蝽亞科為單系群，與Carayon等的研究結果[22]相同。絨獵蝽亞科和光獵蝽亞科的姐妹群關系沒有得到驗證，與2個亞科線粒體基因組序列較少有很大關系。另外，由于獵蝽科昆蟲的形態特征差異顯著，尚無嚴格的分類系統，高級階元間的關系非常混亂。隨著獵蝽科被報道的線粒體基因組序列越來越多，系統發育的研究也將迎來新的進展。

本研究選取了獵蝽科11亞科30屬的代表物種進行比較線粒體基因組學研究，對線粒體基因組的重排現象、堿基組成、密碼子使用情況和蛋白編碼基因的核苷酸進化速率進行分析，并基于13個蛋白編碼基因構建了獵蝽科昆蟲的BI系統發育樹。獵蝽科線粒體基因組呈共線性結構，沒有發現大面積的基因重排現象，只出現了極個別的多拷貝和基因編碼方向與原始序列編碼方向相反的現象。在蛋白編碼基因中，cox1的保守性最高，進化速率最慢;而atp8基因的保守性最差，進化速率最快。BI系統發育樹對獵蝽科各亞科的關系進行了一定的解析，為之后的系統進化研究奠定了一定的基礎，但是由于該科昆蟲本身差異顯著、分類系統混亂，尚需進一步的深入探究。

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