臭氧水與生防菌劑組合應用對番茄根結線蟲及根際微生物群落的影響

魏艷麗 李紅梅 扈進冬 隋麗娜 劉寶軍 趙忠娟 李紀順

摘要：為了明確臭氧水與菌劑組合應用對番茄根結線蟲的防治效果，采用定量接種法探究臭氧水與不同菌劑組合處理對沙培和土培番茄生長、南方根結線蟲防治效果及根際土壤微生物群落的影響。結果表明，單獨臭氧水處理對番茄生長無影響，8 mg/L的臭氧水可顯著減少番茄根系根結的形成，使盆栽番茄根際土中南方根結線蟲群體密度降低90.79%。臭氧水與哈茨木霉T11-W和伯克氏菌B418組合處理，番茄株高和鮮質量與對照相比分別增加61.64%、90.90%，對根結線蟲的相對防效為69.95%。臭氧水與B418組合處理，番茄株高和鮮質量分別增加59.10%、68.86%，對根結線蟲的相對防效為64.39%。臭氧水與哈茨木霉T11-W和伯克氏菌B418組合處理可降低細菌的豐富度，增加真菌群落多樣性和豐富度，顯著降低鏈格孢屬（Alternaria）、鐮刀菌屬（Fusarium）等潛在植物病原真菌的相對豐度。該研究為臭氧水與菌劑組合防治番茄根結線蟲病提供了理論依據。

關鍵詞：臭氧水;番茄根結線蟲;哈茨木霉;越南伯克霍爾德氏菌;微生物群落

中圖分類號：S436.412;S154.3 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）12-0121-06

收稿日期：2021-08-04

基金項目：2018年山東省農業重大應用技術創新項目;齊魯工業大學（山東省科學院）科教產融合項目（編號：2020KJC-GH07）;山東省科學院院（校）地產學研協同創新基金 （編號：2020-CXY11）;山東省重點研發計劃（重大科技創新工程）項目（編號：2020CXGC010803）。

作者簡介：魏艷麗（1978—），女，山東東阿人，碩士，研究員，主要從事植病生防和土壤微生物研究。E-mail：407978851@qq.com。

通信作者：李紀順，研究員，主要從事植病生防和微生物肥料研發等工作。E-mail：yewu2@sdas.org。

根結線蟲（Meloidogyne spp.）是世界上分布最廣、危害最重的植物病原線蟲，每年對全世界作物造成嚴重的經濟損失，它能侵染幾乎所有的蔬菜作物，對保護地蔬菜的危害尤其嚴重[1-3]，已經成為我國設施蔬菜生產的最重要限制因子之一。

目前對根結線蟲的防治主要是以化學藥劑為主，分為熏蒸類和非熏蒸類兩大類，殺線劑對人畜普遍呈現高毒性，用量大易產生抗藥性，長期使用會帶來非靶標生物毒害和環境污染等問題[4-5]，不少高毒性的殺線劑已被禁止使用。利用寄生或捕食性食線蟲菌物、拮抗性根際微生物或致病性病原等進行生物防治是線蟲病害防治研究的主流趨勢，已報道的植物寄生線蟲生防微生物資源有淡紫擬青霉（Purpureocillium lilacinum）菌株 51[6]、堅強芽孢桿菌（Bacillius firmus）菌株 I-1582[7]、厚垣孢普可尼亞菌（Pochonia chlamydosporia）菌株 ZK7[8]、長枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）菌株 T6[9]、橘綠木霉（T. citrinoviride）菌株 Snef 1910[10]、越南伯克霍爾德氏菌（Burkholderia vietnamiensi）菌株 B418[11]等，其中多株優良生防菌株已被開發為生物殺線劑產品。

臭氧是一種具有強氧化性的氣體，在水中分解產生的二級氧化劑——氫氧自由基（·OH），是一種非選擇性的強氧化劑，可破壞微生物膜結構[12]，且極易分解，施用后40 min左右就會分解為氧氣和水，不會對環境造成二次污染，是一種安全、高效、環保的殺蟲滅菌劑[13]。Veronico 等研究發現，澆灌臭氧水可調控番茄的基本防御系統，降低線蟲侵染率[14];Guo等研究發現，0.5 mg/L的臭氧水可在體外抑制蕓薹屬植物病原菌歐文氏菌（Erwinia carotovora）的生長[15];Kobayashi等研究證實，臭氧可使尖鐮孢菌（Fusarium oxysporum）和果膠桿菌（Pectobacterium carotovorum）失去活性[16]。

越南伯克霍爾德氏菌B418和哈茨木霉（T. harzianum） T11-W是筆者所在研究室保存的多功能生防菌株，其中哈茨木霉T11-W對南方根結線蟲分散卵具有寄生作用，是一種潛在的寄生植物線蟲真菌資源[17]，越南伯克霍爾德氏菌B418對番茄和茄子根結線蟲病的防治效果分別為63.42%、75.6%[11]。在以往的試驗中由于土壤中根結線蟲含量較高，單獨使用菌劑對線蟲的防治效果還不甚理想。關于臭氧水與生防菌劑組合使用防治根結線蟲是否會出現疊加或協同的效果尚未見報道。本研究在溫室條件下，研究了沙培和土壤栽培模式下，臭氧水與哈茨木霉T11-W和越南伯克霍爾德氏菌B418菌劑聯合應用對番茄植株生長的影響和對根結線蟲的抑制作用，同時研究了聯合應用對番茄根際土壤微生物菌落的影響，以期為根結線蟲的防治提供安全有效的防控新技術。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試線蟲和植物：南方根結線蟲（Meloidogyne incognita）由筆者所在實驗室自感病番茄根部分離并鑒定;供試番茄為金冠八號，購自濟南偉麗種業有限公司。

供試微生物菌劑為哈茨木霉T11-W 和越南伯克霍爾德氏菌B418，為筆者所在實驗室發酵制備的草炭制劑，有效活菌數均為2×108 CFU/g。

1.2 臭氧發生儀器

試驗所用臭氧水發生器為山東澤恩農業科技股份有限公司生產的土壤消毒滅菌機，臭氧濃度檢測儀為啟立DOZ-30（廣州啟立環保設備有限公司）。

1.3 番茄南方根結線蟲卵（蟲）懸浮液的制備

從根結線蟲發病嚴重地塊挖取感病番茄植株，流動自來水沖洗干凈根部，帶回實驗室。參考Hussey等的線蟲懸浮液制備方法[18]，將洗凈的番茄根用5% NaClO溶液消毒10 min，無菌水沖洗3遍后用滅菌剪刀將根部剪成0.5 cm的小段，然后加入適量無菌水，充分攪拌均勻。將根及溶液依次倒入200目和500目的套篩上，收集500目篩上的卵及少量2齡幼蟲，制成每毫升500個卵（幼蟲）的懸浮液備用。

1.4 土壤中根結線蟲qPCR定量檢測

根據已發布的南方根結線蟲ITS區的保守序列（NCBI：KF418368.1、FJ534516.1）設計特異性引物，預期擴增片段大小為139 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列為MIITS7-F（5′-CCAATTTAATCGCAGTGGCTTG），MIITS127-R（5′-CGACAGCCGTTTCACAACAATA）。

qPCR標準曲線中根結線蟲DNA的提取參考Gorny等的方法[19]，于顯微鏡下挑取1 000條2齡幼蟲，利用MOBIO的土壤DNA提取試劑盒（Power Soil DNA Isolation Kit）提取DNA作為標準品，以其梯度稀釋液作為模板進行實時熒光定量PCR反應，每個標準品重復3次，得到各自循環閾值Cq，通過Cq值與2齡幼蟲的對數值之間的線性關系，建立標準曲線。

qPCR反應參考Zhao等的方法[20]，使用TaKaRa公司的SYBR Premix Ex Taq試劑盒（Perfect Real time）和Bio-Rad公司的iQ5實時熒光定量PCR儀。25 μL 體系如下：SYBR Green 預混液 12.5 μL，20 μmol/L 正向和反向引物各1 μL，模板DNA 1 μL，添加無菌水至終體積25 μL。qPCR反應采用三步法：在95 ℃預變性10 min;95 ℃ 變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共40個循環;循環結束后，樣品加熱到95 ℃，立刻降至60 ℃ 保持5 s，然后每5 s提高0.5 ℃遞增到95 ℃。

1.5 番茄沙培試驗設計

試驗設無菌水對照和臭氧水澆灌2個處理，每個處理20個重復。將長有4張真葉且長勢一致的供試番茄苗種植在裝有滅菌河沙的50 mL塑料離心管中（底部有直徑約2 mm的洞），每管種植1株苗。定植后，在距離番茄根周圍0.5 cm處滴入1 mL的卵（幼蟲）懸浮液，使每株番茄苗接種的卵（幼蟲）數目為2 000個。接種72 h后，向管中加入過量的濃度為8 mg/L臭氧水（以底部剛剛有水流出為準）。根據番茄長勢，每3 d澆1次Hogland溶液[21]，置于光照培養箱（光暗比14 h—10 h，25 ℃）中培養6周后，小心取出整株根系，用自來水沖洗干凈后，采用EPSON掃描儀記錄根系形態，獲取根系圖像，分別測量植株根系及地上部干質量等指標。同時統計番茄根系上的根結數量，并計算根結減退率[9]。

根結減退率=（對照根結數-處理根結數）/對照根結數×100%。

1.6 番茄土壤盆栽試驗

盆栽試驗于2020年9—11月在山東省科學院生態研究所試驗基地（117°15.87′E，36°39.68′N）進行，盆栽土來自于基地連續種植番茄且根結線蟲發病嚴重地塊。除去表層土后，采集0～20 cm土樣，多點采樣混勻后過50目篩。土壤理化性質為：有機質含量22.14 g/kg、全氮含量1.02 g/kg、速效磷含量8.37 mg/kg、速效鉀含量219.16 mg/kg，pH 值6.70，參考劉維志的方法[22]測定根際土壤中根結線蟲數量（以密度計，g/頭）。

試驗用盆為深21 cm、直徑23 cm 的圓形花盆，裝土2 kg/盆。所用臭氧水濃度為8 mg/L。共設5個處理，每個處理6個重復，分別為SO臭氧處理組，澆2 L臭氧水;SOB處理組：澆2 L臭氧水，48 h后加入B418菌劑5 g/盆;SOT處理組：澆2 L臭氧水，48 h后加入T11-W菌劑5 g/盆;SOBT處理組，澆2 L臭氧水，48 h后加入T11-W菌劑5 g/盆和B418菌劑5 g/盆;SCK對照處理組澆等量蒸餾水。定植5株/盆具有4張真葉、長勢一致的番茄苗。依據土壤干濕情況，每間隔3～4 d澆水1次，6周后剪取植株地上部用于測量植株高度和地上部鮮質量。然后取出全部根系，調查所有植株的根系根結數量。

1.7 番茄根際土壤微生物DNA提取及高通量測序

土壤盆栽番茄收獲后，將整株挖出，輕輕抖落根系外圍的大土塊，只收集附著在根系上的土壤作為根際土，5株/盆根際土混合作為1個樣品。稱取0.5 g土壤樣品，利用DNeasy Power Soil DNA Isolation Kit（Qiagen，Valencia，CA）試劑盒，按照說明書提取土壤DNA，最終洗脫體積為70 μL，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量和濃度，一部分用于根際土壤中根結線蟲qPCR定量測定，另一部分用于高通量測序。

土壤微生物DNA高通量測序方法[23]：利用通用引物341F（5′-CCTACGGGNGGCWGCAG）和805R（5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC）對DNA中的細菌基因組16S rRNA的V3～V4區域進行擴增，利用通用引物 ITS3F（5′-GCATCGATGAAGAACGCAGC）和ITS4R（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC）對真菌ITS2區進行擴增。30 μL擴增體系如下：Phusion Master Mix（2×）15 μL，2 μmol/L引物 3 μL，1 ng/μL模板DNA 10 μL，超純水2 μL。PCR反應程序為：98 ℃預變性1 min;98 ℃變性10 s，50 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環;72 ℃延伸5 min。高通量測序采用Illumina Miseq平臺，由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.8 數據處理

番茄根結指數按照0～5級劃分，以根結數量和根受害程度為分級標準[4]，具體如下：0級，根系健壯，無根結;1級，根系上只有極少數根結，且直徑大小在2 mm以內;2級，25%及以內的根系上有根結，未連接成串，且直徑大小在2 mm以內;3級，26%～50%根系有根結，部分根結相連成直徑大于3 mm的不規則根結;4級，51%～75%的根系有根結，多數相連成直徑大于3 mm的不規則根結;5級，76%及以上的根系上有根結，且相連直徑大于3 mm，主、側根呈畸形或腐爛。根結病情指數計算公式如下：

根結病情指數=[∑（各級植株數量×相應的級數）/（調查植株總株數×5）]×100;

相對防效=[（對照根結病情指數-處理根結病情指數）/對照根結病情指數]×100%;

試驗數據采用Excel 010軟件整理、SPSS 1.0軟件統計分析，同一處理樣品數據的差異顯著性采用t檢驗分析。

高通量測序后對各樣本優化序列提取非重復序列，去冗余序列后按照97%相似性對非重復序列 （不含單序列） 進行OTU聚類，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTU的代表序列。16S擴增片段使用RDP Classifier比對RDP數據庫;ITS使用Blast比對UNITE數據庫，最終分別在域（domain）、門（phylum）、綱（class）、目（order）、科（family）、屬（genus）、種（species）等各個分類水平上統計各樣本的群落組成，應用mothur軟件計算Shannon、Chao等多樣性指數[24]。

2 結果與分析

2.1 根結線蟲qPCR標準曲線的建立

利用引物MIITS7-F/MIITS127-R建立根結線蟲的標準曲線，Cq值與根結線蟲2齡幼蟲量的對數值之間呈顯著負相關性，標準曲線方程為y=-3.529x+30.297，決定系數r2=0.983 8，表明建立的實時熒光PCR標準曲線具有良好的線性關系。

2.2 臭氧水對沙培番茄生長的影響及根結線蟲的作用

番茄沙培6周后，各處理間植株的地上部和根系干質量并無顯著性差異（表1），但植株根系形態和根結發生現象差異明顯（圖2），對照處理組須根較少，在近主根的位置形成多個根結，且部分互連形成5 mm以上的大根結;而臭氧水處理的番茄植株須根較多，根結個體直徑多在2 mm以內，主要分布在須根末端，且數量較少，平均根結減退率為64.40%，與對照相比差異顯著（P<0.05）。

2.3 不同處理對土培番茄生長和根結線蟲的防治效果

番茄土壤盆栽6周后，臭氧水單獨處理組（SO）株高和單株鮮質量與對照相比無顯著差異。臭氧水與菌劑組合的2個處理均可促進番茄株高和單株鮮質量增加（表2），其中與T11-W和B418組合處理組（SOBT）增加最顯著（P<0.05），對株高和鮮質量的增加率分別為61.64%、90.90%;其次是臭氧水與B418組合處理組（SOB），對株高和鮮質量的增加率分別為59.10%、68.86%。

對照處理組番茄植株根結線蟲病害發生嚴重，其根結病情指數達79.2，而臭氧水單獨或與菌劑組合處理都可抑制根結的產生，與對照相比根結病情指數顯著降低（P<0.05）。SOBT和SOB處理組對根結線蟲病的相對防效分別為69.95%、64.39%，二者之間無顯著差異;SO處理組相對防效為55.06%。

2.4 不同處理對根際土壤根結線蟲數量的影響

利用qPCR檢測根際土壤中南方根結線蟲蟲口密度結果見圖3，各處理根際土壤中南方根結線蟲密度存在著顯著差異（P<0.05）， 對照處理組（SCK）密度最大，為174.41頭/g。臭氧水及其菌劑聯合處理組檢測出的南方根結線蟲密度顯著減少，其中單獨臭氧處理組SO密度最小，為16.07頭/g;臭氧+B418組合處理組SOB和臭氧+B418+T11-W 組合處理組SOBT之間差異不顯著，分別為36.24、30.49頭/g。

2.5 不同處理對盆栽番茄根際微生物群落多樣性和豐富度的影響

Chao指數可反映群落物種豐富度，其值越大，表明樣品中生物群落豐富度越高。由表3可以看出，單獨臭氧水處理組SO與對照SCK相比細菌Chao指數降低，真菌Chao指數無顯著變化;臭氧水與菌劑組合處理組與對照相比細菌Chao指數無顯著差異，真菌Chao指數顯著增加（P<0.05）。 臭氧水與2個菌劑聯合處理組SOBT降低了細菌Chao指數，增加了真菌Chao指數。臭氧水與菌劑聯合可以增加根際土壤中真菌的豐富度，降低細菌的豐富度。

Shannon指數和Simpson指數反映了樣品中微生物群落的多樣性，Shannon指數值越大說明群落多樣性越高;Simpson指數則相反，值越大說明群落多樣性越低。由表3可知，所有處理間細菌的Shannon指數和Simpson指數沒有顯著變化。在真菌方面，臭氧水單獨處理或與菌劑聯合處理都可顯著增加真菌的Shannon指數（P<0.05），且臭氧水參與的3個處理之間沒有顯著差異。表明臭氧水或與菌劑聯合處理不會影響細菌群落多樣性，但可以增加真菌群落多樣性。

2.6 不同處理對盆栽番茄根際微生物群落結構的影響

在門分類水平上，各處理番茄根際土壤中鑒定得到的細菌歸屬于23個門，主要分布在變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、放線菌門（Actinobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）等。其中Proteobacteria為優勢菌，占比44.15%～47.04%。不同處理之間沒有顯著差異。

各處理番茄根際土壤中鑒定得到的真菌主要來自8個門，其中子囊菌門（Ascomycota）、油壺菌門（Olpidiomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）為優勢菌。各處理中根際土壤真菌群落結構構成相近，但臭氧水處理番茄根際土壤各真菌類群所占比例發生了明顯的變化，如臭氧水與菌劑組合可顯著增加子囊菌門和油壺菌門的相對豐度。

根據物種注釋結果，選取每個樣品在各分類屬水平上最大豐度排名前14的物種，生成物種相對豐度柱形累加圖（圖4）。分析表明，臭氧水處理可使番茄根際土壤真菌群落組成發生顯著改變，被毛枝葡萄孢屬（Botryotrichum）、鏈格孢屬（Alternaria）、鐮刀菌屬（Fusarium）、被孢霉屬（Mortierella）等相對豐度減少。其中臭氧水與T11-W和B418聯合處理組SOBT的鏈格孢屬相對豐度降低97.61%，鐮刀菌屬相對豐度降低42.27%。

3 討論與結論

土壤中根結線蟲群體密度與作物的受害程度關系密切[25]，準確檢測和定量根結線蟲群體密度對病害防治至關重要。實時熒光PCR技術已廣泛應用于植物病原菌和線蟲的定量檢測中，本研究利用SYBR Green Ⅰ染料，采用南方根結線蟲特異性引物MIITS7-F/MIITS127-R和循環閾值（Cq）（r2=0.983 8），建立了不同線蟲數量的高質量標準曲線，可用于定量檢測土壤樣品中南方根結線蟲的數量。

在根結線蟲群體密度低的情況下，生防菌可通過產生代謝物或者提高植物抗逆性來實現根結線蟲病的防治作用，但若群體密度過高，生防效果將大打折扣。本研究在定植前澆灌8 mg/L臭氧水，可降低根結線蟲群體密度，再接種哈茨木霉、越南伯克霍爾德氏菌，植入大量的有益微生物，不僅可以通過競爭抑制根結線蟲，同時還可誘導植物抗性，促進植物生長，呈現增效作用，對番茄株高和鮮質量分別增加61.64%和90.90%，對根結線蟲病的相對防效達到69.95%。

臭氧極強的滅生性氧化作用，不僅能抑制線蟲的存活，對土壤中有益微生物也會產生影響。在臭氧處理對土壤微生物群落結構的影響方面尚存在爭議，如王永強等研究認為，臭氧水噴灑對設施植物根際微生物群落多樣性影響不大[26]，而陳展等的試驗則表明，高濃度臭氧水可抑制小麥土壤微生物總量，降低微生物多樣性指數[27]。本研究發現 8 mg/L 臭氧水澆灌處理6周后，細菌和真菌的群落結構并未發生顯著變化。但臭氧水與菌劑聯合處理可降低細菌的豐富度，增加真菌群落多樣性和豐富度，進一步分析發現，臭氧水及菌劑組合可顯著降低鏈格孢屬、鐮刀菌屬等潛在植物病原真菌的相對豐度。扈進冬等研究發現，哈茨木霉LTR-2拌種可以增加小麥根際真菌群落的豐富度[28]，說明臭氧水與菌劑組合處理對番茄根際土壤微生物群落的影響主要是由于菌劑的作用引起的。

綜上所述，臭氧水與哈茨木霉T11-W和越南伯克霍爾德氏菌B418制劑聯合，具有協同增效作用，能夠有效防治番茄根結線蟲病害，增加植株鮮質量，顯示出較好的防病和增產效果，二者聯用可替代部分化學農藥。臭氧水與菌劑聯用還增加了根際土壤真菌群落多樣性和豐富度，降低鐮刀菌等潛在植物病原真菌的相對豐度，促進了植物根系發育和作物生長。

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