基于網絡藥理學探討補陽還五湯治療特發性肺纖維化的生物學機制

宋思雨 丁露 李雅馨 王菁 魏萊 王子元 趙佳超 李香艷 王澤玉

(長春中醫藥大學 1中西醫結合學院，吉林 長春 130117；2吉林省人參科學研究院;長春中醫藥大學 3附屬醫院肺病科；4中醫學院)

To explore the biological mechanism of Buyang Huanwu Decoction on idiopathic pulmonary fibrosis based on network pharmacology

SONG Si-Yu，DING Lu，LI Ya-Xin，etal.

College of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，Changchun University of Chinese Medicine，Changchun 130117，Jilin，China

【Abstract】ObjectiveTo predict the potential targets and possible mechanisms of the Buyang Huanwu decoction (BYHWT) for the treatment of idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) using a network pharmacology study, and to validate in vitro experiments by transforming growth factor (TGF)-β1-induced epithelial-mesenchymal transition (EMT) in alveolar epithelial cells A549.MethodsAccording to the principle of network pharmacology, the potential targets of BYHWT in the treatment of IPF were obtained.Cytoscape software drawing, STRING network platform and metascape database were used for protein interaction(PPI) network, gene ontology(GO) and kyoto encyclopedia of genes and genomes(KEGG) enrichment analysis.TGF-β1-induced alveolar epithelial cells were used as the in vitro model.Experimental validation of network pharmacological prediction signaling pathway was carried out.ResultsThe network pharmacology predicted 168 potential targets of BYHWT for the treatment of IPF, and the signaling pathways associated with KEGG enrichment analysis were PI3K/AKT signaling pathway, nuclear transcription factor(NF) -κB signaling pathway, and FOXO signaling pathway. Cell experiment results showed that compared with the model group, BYHWT could significantly down-regulate the protein levels of p-Akt1/2/3 and phosphorylated NF-κB inhibitor protein (p-IκBα), and the gene expressions of EMT-related marker proteins type Ⅰ collagen(Coll)A1, snail and vimentin were significantly down-regulated at RNA level(P<0.05).ConclusionsBYHWT has the characteristics of multi-component, multi-target and multi-pathway to preventing and curing IPF, which plays a main role in the treatment of IPF by inhibiting the PI3K/Akt/NF-κB signaling pathway.

【Keywords】 Network pharmacology；Buyang Huanwu decoction；Idiopathic pulmonary fibrosis；Epithelial-mesenchymal transition；PI3K/AKT/NF-κB

特發性肺間質纖維化(IPF)是由不明原因引起的一種慢性、進行性、間質性的肺疾病〔1〕。該病的發病率和死亡率較高，目前仍缺乏有效的治療手段〔2,3〕。盡管IPF的發病機制尚未清楚，但大量證據表明上皮間質轉化(EMT)的發生是導致IPF的主要原因之一〔4,5〕。EMT的典型特征為α-平滑肌肌動蛋白(SMA)、鋅指蛋白(Snail)、波形蛋白(Vimentin)上調〔1，6，7〕。轉化生長因子(TGF)-β1是纖維化疾病中最有效的誘導劑之一，肺泡上皮細胞經TGF-β1刺激后能夠向EMT轉化〔8〕。

IPF在中醫歸屬于“肺痿”“肺痹”等范疇，發病過程中“淤血”始終貫穿其中〔9〕。補陽還五湯(BYHWT)是益氣活血的代表方，臨床應用發現其對IPF的治療有較好的效果。經現代藥理學證實，BYHWT調控炎癥因子的釋放，抑制成纖維細胞增殖，干預EMT進程等〔10〕。但關于多成分多靶點的BYHWT治療IPF具體機制的報道尚不明確。本實驗采用網絡藥理學的方法篩選BYHWT治療IPF的潛在靶點和通路，并探討該方對A549人源肺泡上皮細胞的EMT作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 細胞 A549人源肺泡上皮細胞來源于中國科學院上海細胞生物研究所細胞庫。藥品與試劑：BYHWT藥物組成為黃芪、當歸尾、赤芍、川芎、桃仁、紅花、地龍(長春中醫藥大學附屬醫院)〔11〕。RPMI1640培養基(Sigma，美國)；胎牛血清(Clark，美國)；胰蛋白酶、青鏈霉素混合液、磷酸緩沖鹽溶液(BI，以色列)；TGF-β1(MCE，美國)；蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑(Roche，瑞士)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(碧云天)；p-Akt1/2/3、磷酸化NF-κB抑制蛋白(p-IκBα；Santa Cruz，美國)；SMA(CST，美國)；微管蛋白(Tubulin)(Proteintech，美國)二抗：羊抗兔、羊抗小鼠(Proteintech，美國)；總RNA提取試劑盒、cDNA反轉錄試劑盒、SuperReal熒光定量預混試劑增強版(天根)PCR引物(生工)。

1.2實驗儀器 CO2培養箱(Esco，新加坡)；蛋白電泳儀、濕式轉印槽、實時熒光定量PCR儀(Bio-red，美國)；倒置顯微鏡(Nikon，日本)；離心機(Eppendorf，德國)。

1.3BYHWT成分及靶點篩選 在TCMSP數據庫，設置篩選條件為口服生物利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18和TCMID數據庫收集BYHWT中黃芪、當歸、赤芍、川芎、紅花、地龍和桃仁的化學成分及相應的靶點，結合Swiss Target Prediction數據庫對活性成分進行靶點預測，并將以上所獲得靶點提交Uniprot蛋白數據庫，獲得相應的人源基因靶點的名稱。

1.4IPF差異性表達基因的收集 利用GeneCards數據庫檢索IPF相關靶標與1.3所收集的靶點取交集對比，最終得到BYHWT治療IPF的潛在作用靶點。

1.5蛋白互作PPI網絡的構建 在線網站STRING上傳1.4得交集結果，物種設定為“Homo sapiens”，最低互作分數為“Medium confidence(0.400)”，其余參數選擇為默認值。

1.6核心靶點的京都基因與基因組百科全書(KEGG)與基因本體(GO)富集分析 設置條件 “Input as species：Homo sapiens，P<0.01”，在Metascape網站輸入1.4交集靶點得到的Gene Symbol進行KEGG、生物過程(BP)、分子功能(MF)和細胞組分(CC)富集分析。

1.7BYHWT抗IPF體外驗證實驗

1.7.1BYHWT的制備 中藥水煎液，將其過濾、離心取上清。經濃縮后，于真空干燥機中60℃烘干成粉末。使用時間，取10 mg復方粉末溶于10 ml PBS中，配制為1 mg/ml儲備液。經0.22 μm濾膜后，置于4℃保存。

1.7.2細胞培養及分組干預 A549細胞培養于RPMI1640培養基(含10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液)。培養條件為：37℃，5%CO2的培養箱。設置對照組：完全培養基；模型組：5 ng/ml TGF-β1；治療組：5 ng/ml TGF-β1，BYHWT：62.5 μg/ml，干預48 h〔11〕。

1.7.3Western印跡法檢測相關蛋白表達 用放射免疫沉淀(RIPA)裂解緩沖液從A549細胞中提取總蛋白。運用BCA法定量蛋白。在8%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE,30 μg)進行電泳分離各組樣本中的蛋白并轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。室溫環境下，用5%BSA-TBST溶液在搖床上封閉1 h。在4℃搖床中孵育一抗過夜。次日，用含0.05% Tween-20的TBS緩沖液在搖床上洗膜5次，5 min/次。室溫中孵育1 h二抗。洗膜同上。用電化學發光(ECL)試劑盒對條帶進行顯色。使用以下一抗：p-Akt1/2/3(1∶500)，p-IκBα(1∶1 000)，α-SMA(1∶1 000)，Tubulin(1∶5 000)。

1.7.4qRT-PCR 收集細胞上清液，用PBS清洗兩遍。按總RNA提取試劑盒的說明書操作：加入裂解液350 μl和10 μl Proteinase K，吹打消化細胞至板底干凈。收集裂解液至1.5 ml離心管中至離心機中，以12 000 r/min、4℃離心5 min。取上清液加入基因組DNA去除柱中，12 000 r/min離心30 s，將所得濾液保留。將濾液中緩慢加入同等體積的70%乙醇，輕微混勻，轉入RNase-Free吸附柱CR4中，12 000 r/min離心30 s，棄收集管中的廢液。在CR4管中加入500 μl漂洗液RW，室溫置2 min，12 000 r/min離心60 s，棄去廢液，將CR4放回收集管中，重復兩次。12 000 r/min離心2 min，棄掉廢液。RNase-Free吸附柱CR4置于室溫2 min，轉移到一個新的RNase-Free離心管中，加入30 μl RNase-Free ddH2O溶解RNA，室溫靜置2 min，再以12 000 r/min離心2 min，獲得RNA溶液。cDNA反轉錄試劑盒、PCR熒光定量試劑盒按試劑盒的流程操作。用2-ΔΔCT法進行定量計算。CollA1：上游引物：5′-TTCTGCAACATGGAGACTGG-3′，下游引物：5′-AATCCATCGGTCATGCTCTC-3′；Vimentin:上游引物：5′-GGACCAGCTAACCAACGACA-3′，下游引物：5′-AAGGTCAAGACGTGCCAGAG-3′;Snail:上游引物：5′-CTCGGACCTTCTCCCGAATG-3′；下游引物：5′-AAAGTCCTGTGGGGCTGATG-3′；GAPDH：上游引物：5′-CACCCACTCCTCCACCTTTG-3′，下游引物：5′-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′。

1.8統計學方法 采用GraphPad Prism8軟件進行單因素方差分析、Tukey-Kramer檢驗。

2 結 果

2.1BYHWT的有效成分及靶點預測 在TCMSP數據庫收集BYHWT有效成分,將其與TCMID與Swiss Target Prediction搜集地龍成分及靶點刪除重復值篩選出110個有效成分和348個靶點。

2.2BYHWT治療IPF潛在作用靶點預測 依托GeneCards數據庫獲得治療IPF潛在基因靶點3 054個,將篩選條件設置為“Relevance score≥4.56”，剩余1 531個靶點。將BYHWT活性成分的靶點與IPF靶點相匹配，獲取潛在核心靶點168個。

2.3“疾病藥物交集靶點-成分圖”的網絡分析 利用Cytoscape3.7.1作圖軟件構建BYHWT有效成分關鍵作用靶點網絡圖，分析BYHWT治療IPF的機制。左側圈代表活性成分作用的靶點，右側圈代表活性成分(以Mol ID表示)，圈的大小代表度值(Degree)的高低。邊代表活性成分和靶點的相互作用關系。圖中一個節點的Degree值的含義是和該節點相連的節點數目。如果這個節點的Degree較大，說明這個節點在這個網絡圖中是樞紐作用，表明此點是關鍵的靶點或者化合物，見圖1。

圖1 疾病藥物交集靶點-成分

2.4BYHWT治療IPF關鍵作用靶點PPI網絡 將168個關鍵靶點上傳至STRING數據庫，得到的PPI圖。圖中有節點168個、邊3 646條、平均節點數43.4，見圖2。

2.5核心靶點的GO富集分析和KEGG通路分析 在Metascape數據庫，運用GO和KEGG對168個核心靶點進行分析。取BP、CC、MF前20排名結果，見圖3。在BP中，炎癥反應、細胞對化學應激的反應、對細菌源性分子的反應、活性氧代謝過程、對傷害的反應等排名靠前。在MF中，主要包括DNA結合轉錄因子結合、激酶結合、細胞因子受體結合、蛋白域特異性結合、磷酸酶結合等。在CC中，主要是膜筏、囊泡腔、細胞外基質、液泡等。

KEGG信號通路分析顯示，癌癥通路、AGE-RAGE信號通路在糖尿病并發癥中、麻疹、磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)信號通路、NF-κB 信號通路與168個核心靶點關系密切。

圖2 BYWHT治療IPF靶點PPI網絡

2.6TGF-β1對A549細胞形態學影響 在倒置顯微鏡下觀察各組細胞形態，對照組A549細胞48 h細胞的形態呈鵝卵石樣，細胞大小均勻，沒有突觸或多角，貼壁狀態良好。經TGF-β1刺激后細胞形態向梭形改變，圓形度明顯降低，與成纖維細胞形態相似，見圖4。

2.7BYHWT對EMT、PI3K/Akt/NF-κB標志蛋白影響 根據預測靶點的KEGG通路的富集結果顯示，PI3K-Akt、NF-κB、FOXO信號通路排名靠前，對PI3K/Akt/NF-κB信號通路的標志蛋白進行體外實驗驗證。與模型組相比，治療組下調EMT標志蛋白α-SMA和PI3K/Akt/NF-κB信號通路標志蛋白p-Akt1/2/3、p-IκBα水平，見表1。

圖3 BYHWT抗IPF的KEGG、GO分析

表1 BYHWT對TGF-β1誘導A549細胞中α-SMA、 p-Akt1/2/3和p-IκBα蛋白表達的影響

2.8BYHWT對EMT相關mRNA影響 與對照組相比，TGF-β1促進了CollA1、Vimentin、Snail的mRNA表達(P<0.05)。經BYHWT干預后，Col1A1、Vimentin和Snail轉錄因子水平顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 BYHWT對TGF-β1誘導A549細胞中CollA1、 Vimentin和Snail基因表達的影響

3 討 論

肺纖維化是一種慢性進行性呼吸性肺疾病，具有快速導致呼吸衰竭和高死亡率的特點〔12〕。IPF是肺纖維化中最常見的形式〔13〕。BYHWT始載于清代王清任所撰《醫林改錯》，方中重用黃芪補氣通絡，當歸尾、川芎養血行氣不傷本，地龍善于通經活絡，赤芍、桃仁、紅花助當歸尾活血通絡，使氣旺血行以固本，散淤通絡以治標，終得標本兼治。研究〔14〕發現，BYHWT治療IPF的療效不僅優于單純的西藥治療，還能夠改善患者的生活質量。有研究表明，經BYHWT干預后，IPF患者肺功能明顯高于治療前〔11〕。因此，BYHWT治療IPF的作用機制亟待研究。本研究結果證明，在經BYHWT干預之后，A549人肺泡上皮細胞通過PI3K/Akt/NF-κB通路抑制EMT進程，發揮抗纖維化的作用。

槲皮素是一種自然界中廣泛存在的黃酮類化合物。現代藥理學研究表明，槲皮素具有抗纖維化、抗炎、抗氧化、抗腫瘤等藥理作用〔14〕。有研究發現，槲皮素能夠通過多種途徑發揮抗纖維化的作用〔15～17〕。木犀草素主要通過調控NLRP3/IL-1β/TGF-β1信號軸抑制SiO2誘導的矽肺纖維化〔18〕。這些活性成分的生物學功能從一定程度上證明了預測結果的可靠性。在PPI核心靶點中，TNF、Akt1、IL-6均被報道過參與肺纖維化病程〔16〕，推測BYHWT可能通過調控以上靶點發揮抗纖維化的作用。

KEGG通路富集結果顯示，共得到300條通路，其中相關度較高的通路為癌癥通路，與糖尿病相關AGE-RAGE信號通路，麻疹、PI3K-Akt信號通路、NF-κB和FOXO等信號通路相關。已有研究證明，抑制PI3K/Akt/mTOR或NF-κB信號通路能夠緩解肺纖維化〔17,18〕。

綜上，BYHWT通過降低p-Akt 1/2/3和p-IκBα的表達，抑制PI3K/Akt/NF-κB信號通路的激活和TGF-β1誘導A549細胞EMT的進程。這為BYWHT在臨床應用提供了可能。