微電流刺激對脛骨骨缺損家兔CGRP/PI3K/Akt通路及骨再生的影響

姚玉英 劉娜 郭志利 張宏 范雅麗 金玉祥 楊東浩

(石家莊醫學高等專科學校 1解剖教研室，河北 石家莊 050599；2外科教研室；3微免教研室)

暴力創傷、骨腫瘤切除或感染均可導致骨缺損，且常伴有感染、肢體縮短、骨延遲愈合等多種不良反應，給治療造成較大的困難〔1〕。目前骨缺損治療方法有修復軟組織、骨連接重建等，但由于不能準確清除感染灶，有復發風險，導致治療失敗〔2〕。微電流刺激被認為是電極周圍電化學改變，促進骨形成，電流和化學產物的聯合作用既可以激活破骨細胞，也可以激活成骨細胞，加快骨塑形〔3〕，但在脛骨骨缺損中尚未發現相關研究。降鈣素基因相關肽/磷脂酰肌醇-3激酶/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(CGRP/PI3K/Akt)通路中CGRP位于脊髓前角處，合成CGRP可促進脊髓的修復與再生，并可通過PI3K/Akt通路參與臂叢神經根性撕脫傷病理過程〔4〕，但在脛骨骨缺損中尚未發現研究。因此，本研究以家兔為研究對象，建立脛骨骨缺損模型，探究微電流刺激對脛骨骨缺損的影響，并初步探討其機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 健康雄性家兔30只，平均體重(1.5±0.3)kg，購自河北省實驗動物中心，動物生產許可證號：SCXK(冀)2019-0001，動物使用許可證號：SYXK(冀)2019-0014，動物質量合格證號：2019121307。本研究經石家莊醫學高等?？茖W校倫理委員會批準。

1.1.2試劑與儀器 蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒、蛋白裂解液、硝酸纖維素膜(北京索萊寶科技有限公司，批號分別為：L9406-10、L3017-9、L3063)；CGRP、PI3K、磷酸化(p)-PI3K、Akt、p-Akt單克隆抗體、羊抗兔二抗(英國abcam公司，批號分別為：ab81887、ab139307、ab154598、ab227385、ab105731、ab106013)。雙能量X射線骨密度儀(深圳艾克瑞公司，型號：AKDX-09W-I)；電子萬能材料試驗機、光柵線位移傳感器、拉力傳感器(長春市第二試驗機廠，型號：WD-10B、TSC-3、GZLYG-9)；電感耦合等離子體質譜儀(安捷倫科技有限公司，型號：Agilent 7500cc)；顯微鏡(德國徠卡公司，型號：DM4M)；蛋白凝膠成像系統(上海旦鼎國際貿易有限公司，型號：JS-1030)。

1.2方法

1.2.1動物造模 實驗分為對照組、模型組、微電流刺激組，每組10只。家兔全身麻醉，全身固定在手術臺上，常規脫毛備皮，模型組、微電流刺激組右下肢外側做縱行切口，長約3 cm，牽引器拉開皮膚，鈍器分離皮下組織、脛前肌，暴露出脛骨，截取脛骨中段，骨膜行膜下剝離，電動擺鋸將骨完全截斷，并切除周圍骨膜，制造脛骨干(20±3)mm骨缺損模型；對照組不做任何處理。對骨折區域進行單側固定架固定。微電流刺激組在實驗前對脛骨處電流進行檢測，造模后用跟造模前正常情況下相同電流刺激，1 h/次，1次/d，連續12 w；模型組實驗結束后只單側固定架固定相同天數；同時對照組正常飼養相同天數。動物麻醉清醒后將兔歸籠飼養，術后肌注青霉素20萬U/d，連續3 d，防止感染。

1.2.2X線檢查骨缺損部位情況 第1、2、4、8、12周模型組、微電流刺激組行X線檢查骨缺損部位情況。根據Lane-Sandhu X線評分〔5〕檢測骨愈合情況，從有無新骨形成、骨折線清晰度、骨重塑3個方面進行比較。

1.2.3骨密度、骨灰度及骨鈣、磷含量檢測 第12周所有家兔處死，按照原切口入路切取脛骨，剔除脛骨處肌肉組織，切口缺損區域上、下各約0.5 cm處鋸斷。雙能量X射線骨密度儀檢測骨缺損處骨密度、骨灰度情況。電感耦合等離子體質譜法檢測骨鈣、磷含量。

1.2.4檢測脛骨扭轉剛度和柔韌系數 每組隨機取5個樣本，檢測脛骨標本扭轉剛度和柔韌系數，脛骨特制夾具夾持下，脛骨缺損部位作為實驗部分，電子萬能材料試驗機以加載速度137°/m、光柵線位移傳感器、拉力傳感器同步記錄位移和應力，扭轉實驗機上直接記錄扭矩(Mn)、同步的扭轉角(φ)和橈度(f)，直到脛骨組織破壞，計算扭轉剛度(GJ)=Mn/單位長度的比例極限扭轉角(φp)、柔韌系數(K)=破壞橈度(f1)-比例極限橈度(f2)/破壞載荷(F1)-比例極限載荷(F2)。

1.2.5HE染色觀察脛骨組織形態學情況 每組骨密度檢測后部分組織電動擺鋸切斷，缺損部位或對照的相同部位置于4%多聚甲醛中固定，經甲酸脫鈣后按常規組織切片步驟制備6 μm切片，經蘇木素、伊紅染色后觀察脛骨形態學情況。

1.2.6蛋白免疫印跡檢測脛骨組織中CGRP、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白水平情況 部分骨組織加甲酸脫鈣，加1 ml蛋白裂解液冰上研磨，冰上裂解20 min，3 500 r/min、4℃離心20 min，上清液即為總蛋白。凝膠電泳分離蛋白后硝酸纖維素膜轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗CGRP、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、GAPDH(均為1∶2 000稀釋)，4℃孵育過夜，加入二抗(1∶5 000稀釋)室溫孵育1 h。蛋白凝膠成像系統拍照和定量分析。

1.3統計學分析 采用SPSS23.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗、t檢驗。

2 結 果

2.1微電流刺激對脛骨愈合的影響 與模型組相比，微電流刺激組在第2、4、8、12周Lane-Sandhu X線評分顯著升高(P<0.05)，兩組在第1周Lane-Sandhu X線評分差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 模型組、微電流刺激組不同時間Lane-Sandhu X線評分比較(n=10，分，

2.2微電流刺激對脛骨骨密度、骨灰度、骨鈣、磷含量的影響 與對照組相比，模型組骨密度及骨鈣、磷含量顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，微電流刺激組骨密度、骨鈣、磷含量顯著升高(P<0.05)。各組骨灰度差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

2.3微電流刺激對脛骨扭轉力和抗扭剛度的影響 與對照組相比，模型組脛骨缺損段GJ、K水平顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，微電流刺激組脛骨缺損段GJ、K水平顯著升高(P<0.05)。見表3。

表2 3組脛骨骨密度、骨灰度、骨鈣、磷含量比較

表3 3組脛骨缺損段GJ、K水平及組織中CGRP、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白水平比較

2.4微電流刺激對脛骨組織形態學的影響 對照組骨組織可見脛骨密質骨呈板層狀，骨陷窩中有骨組織，結構完整；模型組骨缺損部位骨小梁粗大，骨小梁間隙較大，僅出現部分新生骨；微電流刺激組骨小梁間隙縮小并逐漸融合形成板層骨，骨缺損區骨痂形成，出現新骨塑形狀態。見圖1。

圖1 3組脛骨組織形態學變化(HE染色，×40)

2.5微電流刺激對脛骨組織中CGRP、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白水平的影響 與對照組相比，模型組脛骨組織中CGRP、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，微電流刺激組脛骨組織中CGRP、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白水平顯著升高(P<0.05)。見圖2、表3。

1～3：對照組、模型組、微電流刺激組圖2 3組脛骨組織中CGRP、PI3K、 p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達情況

3 討 論

脛骨承受整個身體重量，若脛骨的結構或完整性受到破壞，會導致行動不便，影響生活質量〔6〕。但是車輛等原因導致交通事故增加，導致創傷性脛骨損傷發生率呈上升趨勢，這類損傷亦發生感染，導致骨壞死，造成骨缺損〔7〕。骨缺損后骨重建要經歷不同時期，由剛開始的骨缺損1～7 d的炎癥期，骨缺損處出現一系列炎癥反應逐漸發展為肉芽組織；隨著時間的延長，骨缺損2～3 w軟骨結痂形成，肉芽組織被纖維組織與軟骨組織取代；骨缺損3～4個月，硬骨痂形成；經過數月甚至數年，骨單位重建，骨形態得以重建〔8〕。因此，加快骨重建對于治療脛骨骨缺損具有較大意義。傳統治療方法需進行多次手術，患者不僅痛苦，手術治療時間長且費用高。微電流刺激作為傳統骨科治療的有效手段，一直是骨科及相關科室研究熱點，電流刺激經濟便捷、操作簡單、安全性高，且微電流刺激可直接或間接起神經營養因子作用，抑制神經元凋亡、促進周圍神經軸突生長，緩解疼痛，在治療肌性穩定性結構改變造成的腰椎周圍韌帶損傷中有一定療效〔9〕。本研究提示相較于脛骨骨缺損的自動愈合，微電流刺激可加快脛骨骨缺損中骨重建過程。

骨重建過程中，一方面局限性壞死等原因造成的骨萎縮，導致骨量消失，骨密度降低；另一方面骨折鈣化、結痂會增加骨折周圍體積、增加骨量，骨密度升高，可以根據骨密度情況客觀反映骨缺損狀況、預測愈合情況〔10〕。骨密度受骨痂中骨鈣、磷元素的影響，鈣是骨骼正常生長發育所需礦物質，儲存于骨組織中嵌入蛋白質基質中發揮作用〔11〕；在骨愈合過程中添加磷灰石既有骨生長引導作用，又有具有較好的成骨能力和生物相容性〔12〕。在骨損傷中添加鈣-磷涂層可以促進骨再生、增加骨密度〔13〕。本研究結果提示骨損傷后的骨愈合過程中生成的骨鈣、磷含量較少，導致骨密度增加的不明顯，骨重建速度較慢，相比骨自身愈合，微電流刺激可升高骨缺損處骨骼生長礦物質含量、促進成骨分化，促進骨缺損處組織體積增加，骨量、骨密度增加，骨小梁間隙變小逐漸形成板層骨。

脛骨中段的蝶形骨缺損顯著降低了脛骨的抗扭轉、抗彎曲、抗壓縮等能力，完整的脛骨Mn大于黏接后脛骨，黏接后的脛骨Mn大于缺損脛骨〔14〕。抗扭剛度反映抵抗應變的能力和穩定性，剛度值越大，機體抵抗能力和穩定性越強〔15〕。本研究提示單純的骨缺損后黏接愈合速度較慢，且穩定性較差，骨重建緩慢，微電流刺激后可加速脛骨骨缺損的黏接，同時增強抵抗力，促進脛骨骨重建。

CGRP作為骨膜、骨骺等骨組織中重要神經肽，通常以分泌顆粒形式存在于感覺神經末梢中，在骨骼等靶器官中發揮作用，在骨折損傷的創傷修復階段水平升高，具有促進細胞成骨分化能力〔16〕。在骨缺損處，骨缺損早期CGRP能促進細胞增殖，骨缺損后期CGRP能促進新生細胞向成骨細胞分化，從而增強骨重建效果〔17〕。PI3K由催化亞基p110和p85組成，PI3K與細胞表面受體作用后激活催化亞基p110，從而使PI3K活化，產生胞內第二信使3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇，而3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇可活化Akt，Akt進一步激化靶基因參與細胞增殖、凋亡、分化等過程〔18〕；在骨缺損中激活PI3K/Akt通路發揮促成骨分化作用〔19〕。同時發現CGRP可以刺激PI3K/Akt通路相關蛋白磷酸化過程發揮作用〔20〕。本研究提示脛骨骨缺損處單純的骨愈合可以促進新生細胞向成骨細胞分化，促進骨修復；微電流刺激可加速新生細胞向成骨細胞分化，促進骨重建。

綜上所述，微電流刺激可促進脛骨骨缺損后骨重建過程，實現對疾病的緩解，并可能與激活CGRP/PI3K/Akt通路有關。但兔的脛骨骨缺損愈合情況與人類存在一定差異，通過家兔脛骨骨缺損模型預測人類脛骨骨缺損愈合尚需進一步研究。