miR-562下調LncRNA-TRIM52-AS1抑制肝癌細胞惡性增殖

蔡瑜 燕普 常小偉 李武軍 汪海平

(1西安醫學院第一附屬醫院普通外科，陜西 西安 710077；2安徽醫科大學第二附屬醫院)

肝細胞癌(HCC)是常見的原發性肝癌，也是全球范圍內與癌癥相關導致死亡的最常見原因之一〔1〕。乙型肝炎病毒(HBV)感染，慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染、酗酒、黃曲霉毒素B1攝入和代謝綜合征都是導致HCC的高危因素。HBV感染發生率在亞洲最高〔2〕。慢性HBV感染仍無法治愈〔3〕。盡管HCC治療取得了巨大進展，但仍缺乏有效治療HCC的措施〔4〕。正如在許多其他癌癥中觀察到的那樣，HCC腫瘤發生和發展是一個復雜過程，包括關鍵生長調節基因的遺傳和表觀遺傳轉化〔5〕。因此，需要清楚地闡明HCC發生的分子機制，并為HCC患者的早期診斷和治療開發新的策略。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是長度大于200 bp的轉錄本，沒有蛋白質編碼功能〔6〕，代表一類非編碼RNA，在研究中受到的關注較少。研究表明，LncRNA對染色質結構，基因表達和翻譯控制的調控至關重要〔7，8〕。有證據表明，LncRNAs可能在轉錄、轉錄后和表觀遺傳水平上調節關鍵的癌癥途徑〔9〕。有報道稱，人類LncRNA的數量可與蛋白質編碼基因的數量相匹敵〔10〕，但只有少數LncRNA被研究。在過去的幾年中，由于各種新方法的成功應用，包括全基因組范圍內的基因表達篩選，全基因組范圍內的關聯研究，區域性關聯分析和常規連鎖篩選，設計的LncRNA陣列，RIP-RNA測序，轉基因表達及基因敲除，LncRNA在癌癥中的功能正在日益被發掘。已鑒定出多種LncRNA在組織癌變、侵襲和轉移中至關重要〔11～15〕。本研究前期通過高通量測序檢測發現，TRIM52-AS1在HCC中高表達且與臨床預后有顯著相關性，然其在HCC中的作用研究尚不明確，本研究探討TRIM52-AS1在HCC發展進程中的重要作用。

1 材料與方法

1.1研究組織及細胞培養 人HCC細胞HepG2購自美國ATCC細胞庫，培養在含10%胎牛血清的DMEM培養基中，并加入100 μg/ml鏈霉素和100 IU/ml青霉素；細胞培養瓶置于含 5%CO2和 95%濕度的37℃培養箱中。另選取2019年4～7月在西安醫學院第一附屬醫院接受手術治療的30例HCC患者癌組織及癌旁正常組織樣本，均由術中獲取經病理確認后制成石蠟組織標本，低溫液氮留存。

1.2臨床數據篩選 在臨床數據庫GEPIA〔16〕中，通過腫瘤組織/正常組織>2找到在HCC高表達的基因，通過進一步分析，篩選出在HCC中有臨床意義的LncRNA。

1.3實時熒光定量-聚合酶鏈反應(qRT-PCR) 使用primer3(http：//frodo.wi.mit.edu/primer3/)設計特異性qPCR引物；cDNA用滅菌純水稀釋適當的濃度，按照qPCR mix 5 μl，primer 1 μl，cDNA 4 μl的配方加入96孔PCR板中；貼膜，以2 500 r/min離心1 min，將樣品放入qPCR儀器中進行實驗，反應完成后，拷貝數據，進行分析。

1.4細胞轉染及分組 細胞轉染：以6孔板轉染siRNA為例，將1 μl siRNA與250 μl Opti-MEM混勻，1 μl lipo2000與250 μl Opti-MEM混勻，室溫放置5 min，然后將兩部分合并，混勻，靜置15 min，之后逐滴、均勻加入6孔板中的1個孔中。

分組：HepG2細胞，轉染TRIM52-AS1無意義序列siCTL記為敲低TRIM52-AS1表達檢測的對照組(siCTL組)，轉染2條干擾siRNA序列分別記為TRIM52-AS1表達敲低siTRIM52-AS1#1組和siTRIM52-AS1#2組；轉染miR-562 mimic模擬物記為miR-562過表達組(miR-562組)，轉染miR-562-NC記為陰性對照組(NC組)；轉染miR-562反義核酸ASO記為敲低miR-562表達組(miR-562-ASO組)，轉染NC-ASO記為陰性對照組(NC-ASO組)；miR-562-ASO組中共轉染無意義siCTL序列記為miR-562-ASO+siCTL組，miR-562-ASO組中共轉染干擾siTRIM52-AS1序列記為miR-562-ASO+siTRIM52-AS1組。

1.5細胞增殖實驗 消化長滿10 cm盤的細胞，重懸于1 ml新鮮培養基中，用20 μl可鋪1個96孔板的密度鋪細胞，每個實驗組需3個生物重復，鋪好所需的實驗孔數。在5%CO2，37℃條件下孵育。細胞貼壁后即可轉染siRNA。48 h后開始測量吸光度。配制MTS反應液，按照MTS：培養液=1∶20的比例配制反應液。每孔加入100 μl MTS反應溶液，37℃繼續培養。每隔30 min檢測1次吸光度。將培養皿置搖床上低速振蕩10 s以充分溶解結晶物。在490 nm處測量各孔的吸光值(OD值)。將每天的吸光值轉換成代表每日細胞生長的參數，并繪制細胞增殖曲線。

1.6克隆形成實驗 以6孔板細胞為例：每孔鋪2 000個細胞，細胞貼壁后即可轉染siRNA。每個樣品做3個生物重復，待6～14 d后出現肉眼可見克隆，收集細胞，用常溫磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，用甲醇、乙酸比為3∶1的固定液常溫固定5 min，用含0.5%結晶紫的甲醇溶液常溫固定15 min，水洗，直至背景紫色洗掉，室溫晾干進行掃描，用10%醋酸溶液溶解結晶紫，并在OD590 nm測吸光度，繪制數據柱狀圖。

1.7劃痕遷移實驗 10 cm盤的1/4鋪整個6孔板，待細胞貼壁后分別轉染siRNA，待細胞長到90%用槍頭在盤中央劃痕，并用PBS洗1遍，拍攝0 h圖片作為對照，24 h后拍攝實驗組照片。

1.8LncRNA靶標預測 通過網站進行預測LncRNA結合的microRNA及具體位點，從而進行進一步研究。

1.9雙熒光素酶報告基因實驗 將HCC細胞接種到6孔培養板中，使其密度為90%。含有海腎熒光素酶的報道質粒被用作標準參考。將質粒轉染到HepG2細胞中。使用雙重熒光素酶測定系統(普洛麥格，北京，中國)測量熒光素酶活性，根據生產商說明將其轉染48 h后根據海腎熒光素酶活性進行標準化。該測定一式三份進行3個獨立實驗。

1.10統計學方法 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析、K-M生存曲線。

2 結 果

2.1篩選HCC中具有臨床意義的靶基因 研究首先通過GEPIA數據庫篩選出在HCC中相比鄰近正常組織顯著高表達的基因(腫瘤組織/正常組織>2)共1 315個，其中mRNA 1 284個，LncRNA 19個，misc_RNA 12個。研究主要關注LncRNA功能，因此將LncRNA按照表達差異進行排序，同時結合高表達預后差原則，篩選出關鍵基因TRIM52-AS1(圖1)。

2.2TRIM52-AS1在HCC中的表達特征 研究通過GEPIA數據庫探究TRIM52-AS1在HCC中的表達情況，發現369例HCC組織中TRIM52-AS1表達顯著高于160例正常組織(3.32±0.53 vs 2.13±0.41，t=25.302，P<0.001)，同時具有明顯的TRIM52-AS1高表達預后差臨床特征(HR=1.5，P=0.047，圖2)；在30組HCC組織中TRIM52-AS1表達顯著高于癌旁正常組織(26.12±4.36 vs 20.01±2.04，t=6.952，P<0.001)，說明TRIM52-AS1在HCC發生發展中有重要作用。

TPM：每百萬單位的轉錄數圖1 將篩選出的HCC中高表達的LncRNA按表達 差異倍數利用熱圖進行排序

TPM：每萬單位的轉錄數圖2 GEPIA數據庫分析TRIM52-AS1表達與 HCC臨床預后相關性

2.3敲低TRIM52-AS1表達顯著抑制HCC細胞增殖、克隆形成和遷移速率 siTRIM52-AS1#1組(0.23±0.04)和siTRIM52-AS1#2組(0.24±0.03)細胞中TRIM52-AS1相對表達均明顯低于siCTL對照組(1.01±0.01)，差異有統計學意義(F=621.414，P<0.001)，表明敲低TRIM52-AS1表達轉染成功。細胞實驗檢測顯示，敲低TRIM52-AS1表達后HCC細胞增殖速率、克隆形成速率及劃痕遷移速率均顯著減慢(P<0.05，圖3、表1、圖4)。初步證明TRIM52-AS1在HCC中的重要作用。

圖3 敲低TRIM52-AS1表達后HCC細胞克隆形成速率變化

表1 敲低TRIM52-AS1對HCC細胞增殖OD值、克隆形成速率及劃痕遷移速率的影響

圖4 敲低TRIM52-AS1表達后HCC 細胞遷移速率變化(×100)

2.4miR-562可與TRIM52-AS1結合并負向調控其表達 TRIM52-AS1與miR-562存在結合位點(圖5)；通過將TRIM52-AS1野生型和突變型熒光質粒與miR-562過表達載體共轉染至HepG2細胞中，熒光素酶基因報告實驗顯示，過表達miR-562組TRIM52-AS1野生型熒光素酶活性明顯降低(P<0.001)，而對TRIM52-AS1突變型熒光素酶活性無明顯影響(P>0.05)，說明TRIM52-AS1與miR-562靶向結合。與NC組比較，過表達miR-562細胞中，TRIM52-AS1 mRNA表達顯著降低(P<0.05,表2)。表明miR-562是TRIM52-AS1的靶基因，miR-562過表達可顯著抑制TRIM52-AS1表達。

2.5miR-562在HCC中的表達特征，其高表達可顯著促進HCC細胞增殖 研究miR-562在HCC中的特征，發現30組HCC臨床樣本中miR-562表達顯著低于對應癌旁正常組織(20.05±2.34 vs 29.53±3.54，t=12.236，P<0.001)，并有明顯的低表達預后差臨床特征(HR=0.53，Log-rankP=0.026)，且與TRIM52-AS1在HCC中的表達呈現顯著負相關性(r=-0.572，P=0.000，圖6)。進一步發現，miR-562-ASO敲低組HCC細胞增殖速率顯著高于NC-ASO對照組(0.82±0.06 vs 0.45±0.03，t=9.553，P<0.001)，由此證實miR-562在HCC中與TRIM52-AS1存在負向調控關系。

圖5 網站預測TRIM52-AS1的結合靶標以及具體結合位點

表2 TRIM52-AS1與miR-562的結合及調控 關系驗證

圖6 TRIM52-AS1與miR-562在30組臨床樣品中的 表達相關性

2.6miR-562調控TRIM52-AS1 在敲低miR-562表達的細胞中進一步敲低TRIM52-AS1表達后，細胞增殖速率回歸到正常水平(表3)，表明miR-562通過調控TRIM52-AS1表達從而參與HCC的發生發展過程。

表3 miR-562調控TRIM52-AS1對HCC細胞增殖OD值的影響

3 討 論

LncRNA是>200個核苷酸的RNA轉錄物，沒有蛋白質編碼功能。研究表明癌變的分子機制不僅與蛋白質編碼基因有關，而且與非編碼調節性RNA有關〔17〕。研究表明，多種LncRNA在各種類型的實體瘤中均被失調，并且多個LncRNA可通過直接靶向染色質修飾復合物來調節癌癥轉移，這表明LncRNA的異常表達增加了腫瘤發生和癌癥發展的機會〔18～20〕。例如，LncRNA HOTAIR過表達與乳腺癌有關〔21〕；MALAT1的上調與膀胱癌有關〔22〕；LncRNA XIST的下調與膠質母細胞瘤有關〔23〕；PCAT-1的上調與前列腺癌有關〔24〕。研究〔25〕主要探究了TRIM52-AS1在腎癌中的腫瘤抑制作用，與此作用相反的是，本研究發現TRIM52-AS1在HCC中扮演促癌基因角色。

本研究表明，敲低TRIM52-AS1導致HCC細胞增殖、克隆形成和遷移速率顯著減慢說明TRIM52-AS1在HCC發展進程中的促癌作用。為進一步探究TRIM52-AS1在HCC中發揮功能的作用方式，結合數據庫預測分析發現，TRIM52-AS1可與miR-562結合，同時miR-562可顯著負調控其表達，而miR-562在HCC中的表達特征恰巧與TRIM52-AS1相反，miR-562在HCC中顯著低表達且具有明顯的低表達預后差的臨床相關性，敲低miR-562表達也可顯著促進HCC細胞增殖，這些都顯示了TRIM52-AS1與miR-562的負相關性；細胞增殖實驗驗證了TRIM52-AS1促進HCC細胞增殖主要是由miR-562調控所致。

綜上，HCC中TRIM52-AS1高表達，敲低其表達能抑制HCC細胞的增殖、克隆形成和遷移，其發揮作用可能與miR-562低表達有關。