虎杖提取物對小鼠肝癌原位移植瘤及miRNA-204-5p/Jarid2/PTEN 信號通路的影響

李澤山，劉超，申東方，顧小暉，何艷新

（鄭州大學第二附屬醫院，河南 鄭州 450000）

0 引言

中藥虎杖是以植物虎杖的根莖入藥，其藥理作用較多，具有“散淤鎮痛、清熱解毒”之功，其多重藥用功效主要因其復雜的藥物成分，已有研究發現，虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素及大黃甲素均是中藥虎杖的有效藥物成分[1-4]。原發性肝癌是消化系常見的惡性腫瘤，對血管依賴性極強，早期患者無明顯癥狀，但即便早期仍可進行肝內血行性轉移，其浸潤和轉移能力極強[5]。目前臨床對早、中期肝癌主要以外科根治術并輔以放化療進行治療，但治療效果并不理想[6]。中藥是我國傳統醫學的瑰寶，采用現代科學方法積極探索傳統中藥的作用機制，探尋符合我國國情的治療方法是中藥研究的主要方向。虎杖苷提取物已被證實具有抗癌效果[7]，對腫瘤細胞的增殖具有明顯的抑制作用，但其對原發性肝癌的作用卻鮮有報道。本團隊應用不同濃度虎杖提取物，觀察其對小鼠肝癌原位移植瘤的影響，并探索其作用機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及細胞

雄性BALB/c小鼠，共40只，平均體重（19±1）g，周齡（5～6）周，均購自北京華阜康生物科技公司，動物許可證號：SCXK（京）2014-0004。飼養條件：晝夜比12:12，自由飲食，濕度35%～45%。小鼠H22肝癌細胞，購自中國典型培養物保藏中心。

1.2 儀器及試劑

7900HT型Real-tim PCR儀（美國ABI公司）；DYCZ-40D型電泳儀+轉膜槽（北京六一公司）；微量移液器（德國Eppendorf公司）；miRNA-204-5p熒光定量PCR試劑盒（北京六一公司，貨號407106）；含有Jmj C域SMCX蛋白（Jarid2）、人第10號染色體缺失的磷酸酶（PTEN）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）（英國Abcam公司，貨號分別為ab184152、ab267787、ab9484）。

1.3 虎杖提取物制備

虎杖飲片購自我院中藥房，將3kg虎杖飲片粉碎后過60目篩，參照歐水平等[8]提取方法進行，經乙醇回流、乙酸乙酯萃取、物質A保留、濃縮后硫酸回流、干燥、乙醚萃取、氫氧化鈉萃取、物質B保留，保留物混合等步驟。虎杖提取物萃取率為10.33%。

1.4 H22肝癌細胞原位移植瘤模型制備

小鼠H22肝癌細胞原位移植瘤模型制備方法參考崔瑋[9]等改進方法，即復蘇H22細胞，調制細胞懸濁液，細胞密度1×106個/mL，將BALB/c小鼠麻醉后固定于鼠板，切開上腹部，輕壓左肋部，左肝外葉。用25μL微量注射器吸取20μL細胞懸液，向左肝外葉緩緩注入。縫合，消毒，包扎，防止小鼠舔舐傷口造成感染。

1.5 分組及給藥

將32只BALB/c小鼠肝癌細胞原位移植瘤模型制備成功，隨機分為模型組、虎杖提取物低、中、高劑量組，每組8只，另取8只健康且同周齡小鼠作為對照組，虎杖提取物低、中、高劑量組小鼠分別給予虎杖提取物0.1mL、0.2mL及0.4mL配于適量體積的生理鹽水中并灌胃，模型組及對照組給予與虎杖提取物低、中、高劑量組相同體積生理鹽水灌胃，均連續處理28 d。

1.6 小鼠一般情況及臟器指數

記錄各組小鼠實驗前后存活率、體重及器官指數（肝臟指數、脾指數、胸腺指數）。存活率（%）=存活只數/本組總數×100%。器官指數（%）=器官重量/小鼠體重×100%。

1.7 抑瘤率檢測

記錄各組小鼠實驗后平均瘤重及抑瘤率變化情況。瘤重：瘤體盡數剝離后重量。

抑瘤率（%）=[模型組平均瘤重（g）-虎杖提取物各劑量組平均瘤重（g）]/模型組平均瘤重（g）×100%

1.8 肝功指標影響

各組小鼠腹主動脈抽血后置于促凝管中，搖晃后待血液與管壁充分接觸后靜置2h，血清自行分離后抽取上層血清，采用ELISA法檢測各組樣本中丙氨酸氨基轉移酶（ALT），天門冬氨酸氨基轉移酶（AST），谷氨酰轉移酶（GGT）的含量，操作過程由專業實驗員進行，流程嚴格參照說明書進行。

1.9 瘤體miRNA-204-5p表達檢測

將瘤體放入液氮中，進行冷研磨后進行總RNA提取，使用Real-tim PCR儀對腫瘤樣本中miRNA-204-5p表達進行檢測，檢測流程嚴格參照miRNA-204-5p試劑盒說明書進行，檢測相關試劑使用試劑盒自帶分裝試劑，2-ΔΔCt法計目標mRNA相對表達量。

1.10 Western blot檢測瘤體Jarid2/PTEN信號通路表達

將各組腫瘤組織進行冷研磨后提取總蛋白并配置上樣液。將各樣本上樣液加入10%分離膠缺口，進行常規SDS-PAGE電泳；將藍色膠帶于60V電壓下轉移至PVDF膜，并使用2mL脫脂牛奶拮抗多非特異性蛋白，封閉2h，PBS溶液水平搖床洗膜10min后，使用一抗（Jarid2、PTEN、GAPDH）封閉狀態過夜；次日取出后常溫下放置20min后進行洗膜去除多余一抗液體，常溫下使用羊抗兔二抗進行孵育，1h后洗去二抗，加入ECL試劑放入暗盒中顯影拍照。

1.11 統計學處理

采用GraphPad Prism 6.0軟件進行統計，計量資料以（±s）表示，計數資料采用χ2檢驗，采用多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，多組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠存活率、體重及臟器指數

對照組、模型組、虎杖提取物低、中、高劑量組存活只數分別為8、7、7、8、7只；存活率分別為100%、87.5%、87.5%、100%及87.5%，各組小鼠存活率無明顯統計學差異（P>0.05）。與對照組比較，模型組體重及胸腺指數降低（P<0.05），肝臟指數及脾指數升高（P<0.05）；與模型組比較，虎杖提取物低、中、高劑量組體重及胸腺指數升高（P<0.05），肝臟指數及脾指數降低（P<0.05），且存在劑量依賴性（P<0.05），見表1。

表1 各組小鼠體重及臟器指數情況（±s）

表1 各組小鼠體重及臟器指數情況（±s）

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與虎杖提取物低劑量組比較，cP<0.05；與虎杖提取物中劑量組比較，dP<0.05

2.2 各組小鼠肝功能生化指標變化情況

與對照組比較，模型組血清ALT、AST及GGT含量均升高（P<0.05）；與模型組比較，虎杖提取物低、中、高劑量組上述指標均降低（P<0.05），且存在計量依賴性（P<0.05），見表2。

表2 各組小鼠肝功能生化指標情況（±s）

表2 各組小鼠肝功能生化指標情況（±s）

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與虎杖提取物低劑量組比較，cP<0.05；與虎杖提取物中劑量組比較，dP<0.05

2.3 各組小鼠瘤重及抑瘤率情況

與模型組比較，虎杖提取物低、中、高劑量組瘤重降低（P<0.05），抑瘤率升高（P<0.05），且存在劑量依賴性（P<0.05），見表3。

表3 各組小鼠瘤重及抑瘤率情況（±s）

表3 各組小鼠瘤重及抑瘤率情況（±s）

注：與模型組比較，bP<0.05；與虎杖提取物低劑量組比較，cP<0.05；與虎杖提取物中劑量組比較，dP<0.05

2.4 各組小鼠腫瘤組織中miRNA-204-5p表達情況

模型組、虎杖提取物低、中、高劑量組小鼠腫瘤組織中miRNA-204-5p相對表達量分為為（1.08±0.04）、（1.34±0.08）、（1.57±0.19）及（1.89±0.16）；與模型組比較，虎杖提取物低、中、高劑量組miRNA-204-5p表達升高（P<0.05），且呈劑量依賴性（P<0.05）。

2.5 各組小鼠腫瘤組織中Jarid2、PTEN表達情況

與模型組比較，虎杖提取物低、中、高劑量組小鼠腫瘤組織中Jarid2表達降低，PTEN表達升高，且呈量依賴性（P<0.05），見圖1、表4。

表4 各組小鼠腫瘤組織中Jarid2、PTEN表達情況（/GAPDH，±s）

表4 各組小鼠腫瘤組織中Jarid2、PTEN表達情況（/GAPDH，±s）

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與虎杖提取物低劑量組比較，cP<0.05；與虎杖提取物中劑量組比較，dP<0.05

圖1 組小鼠腫瘤組織中Jarid2、PTEN表達電泳圖

3 討論

腫瘤防治是近幾年醫學研究的熱點及主題之一，肝癌在腫瘤中具有治愈率低、復發性高、病死率高的特點[10]，尋找新的輔助治療方法有可能是提高肝癌治愈率，改善患者生活質量的有效方法之一。中藥虎杖近些年被證實與保護肝臟有關，虎杖中最為重要的中藥單體虎杖苷是白藜蘆醇與葡萄糖的結合產物，可改善休克大鼠肝細胞線粒體膜電位和線粒體通透性轉換孔開方程度，減輕肝細胞線粒體損傷，保持肝細胞活性，從而保護肝臟功能[11]。另有研究顯示[12]，虎杖苷可降低慢性肝硬化患者肝星狀細胞活力，減少纖維化關鍵蛋白表達，從而抑制肝臟纖維化形成。劉嘉輝等[13]應用現代軟件數據庫對中藥虎杖中17個主要成分與肝癌與PharmMapper數據庫269個預測靶點的作用進行相互交集測定，證實中藥虎杖提取物與肝癌細胞有35個潛在結合靶點，可有效抗擊肝癌，這也是本研究選擇探究虎杖提取物對肝癌原位移植瘤影響的理論之一。

本研究結束后首先對各組小鼠體重、臟器指數及血清肝功能指標進行檢測，結果顯示，肝癌原位移植瘤小鼠較健康小鼠體重及胸腺指數降低，肝臟指數、脾指數及肝功能指標ALT、AST、GGT血清含量升高。這表明肝癌原位腫瘤移植成功后，腫瘤其瘋狂生長的特性吸取大量小鼠體內營養物質，增加腫瘤瘤體質量，致門靜脈高壓，脾功能亢進[15]，同時小鼠胸腺萎縮[14]，從整體說明肝癌原位移植瘤復制成功。而經虎杖提取物治療后，小鼠血清肝功能指標ALT、AST、GGT含量及肝、脾指數降低，胸腺指數升高，且存在劑量依賴性，說明虎杖提取物可改善肝癌原位移植瘤小鼠肝功能及整體內臟狀態，并且隨劑量的增加而加強臨床療效。

在腫瘤動物模型中，瘤重及抑瘤率是藥理學作用效果最直接的體現，尤其在肝癌實驗中是必不可少的直接證據[16]。本研究結果顯示，肝癌原位移植瘤小鼠經虎杖提取物治療后，瘤重降低，抑瘤率升高，且存在劑量依賴性，說明高劑量虎杖提取物可最大限度地抑制肝癌細胞增殖，減緩腫瘤組織生長速度，是虎杖提取物可在整體動物實驗層面抑制肝癌發展最直接的證據。

為了深入探究虎杖提取物抑制肝癌原位移植瘤生長，并改善小鼠整體狀態的深層機制，本研究對各組小鼠腫瘤組織中miRNA-204-5p/Jarid2/PTEN信號通路進行檢測。miRNA-204-5p已被證實為抑癌調節基因，改善腫瘤微環境，可限制腫瘤細胞生長[17-18]。另有研究顯示，Jarid2是miRNA-204-5p的下游蛋白，并且Jarid2蛋白在多種癌癥的發展中均扮演關鍵角色，對腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲均具有促進作用[19]，并且與葡萄膜黑色素瘤患者的低存活率相關，但在肝癌研究中尚鮮有報道[20]。PTEN蛋白在腫瘤細胞遷移和侵襲中起關鍵作用，受多種蛋白調節，其中包括Jarid2蛋白[21]。而本研究結果顯示，虎杖提取物可有效提高肝癌原位移植瘤中抑癌調節基因miRNA-204-5p及PTEN表達，降低Jarid2蛋白表達，且存在劑量依賴性。這表明高濃度的虎杖提取物可能通過影響miRNA-204-5p/Jarid2/PTEN信號通路表達，抑制腫瘤細胞生長，升高抑瘤率，達到改善抑制肝癌進展，減輕肝癌對周圍組織壓迫，改善內臟指數及肝功能的目的。

綜上所述，虎杖提取物可有效抑制小鼠原位移植瘤生長，其機制可能與影響miRNA-204-5p/Jarid2/PTEN信號通路有關，值得進一步深入研究。