聯合檢測BRD4、SSBP1與PCDH17在胃癌早期診斷中的應用價值

殷曉霞，李 永，白 睿，劉 博，孫改霞

(1.河北北方學院附屬第一醫院病理科，河北 張家口 07500；2.河北北方學院附屬第一醫院醫學影像科，河北 張家口 075000)

臨床中，胃癌為較常見的惡性腫瘤，雖然手術聯合放化療有助于改善早期胃癌患者預后，但部分患者預后仍較差[1]。因此，探尋胃癌的發病機制，明確其早期診療靶標，對于胃癌臨床診療意義重大。溴結構域蛋白4(bromodomain protein 4，BRD4)為溴結構域和超末端結構家族成員，有研究顯示，BRD4參與腫瘤血管生成、腫瘤細胞增殖、轉移、侵襲等過程[2]。線粒體單鏈DNA結合蛋白(single-stranded DNA binding protein，SSBP1)是線粒體DNA合成的重要因子，其可對線粒體生物功能產生一定影響[3]。既往研究顯示，SSBP1與肺腺癌、肝癌等腫瘤有關[4-5]。另有研究報道，腫瘤相關蛋白可對腫瘤細胞的生物學特征造成一定影響，致使腫瘤細胞的黏附能力發生變化[6]。原鈣黏蛋白17( proto-cadherin 17，PCDH17)是一種鈣依賴性跨膜蛋白，在多種腫瘤組織中表達異常[7]。因此，本研究探討了BRD4、SSBP1、PCDH17與胃癌的關系，旨在為胃癌的早期診療提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月—2020年10月于我院接受手術切除、消化內鏡黏膜下剝離術或胃鏡活檢的150例患者納入研究，術前均未經放化療治療。其中，胃癌組織組(50例)：均經術后病理診斷為原發性胃癌，男性26例，女性24例；年齡31～73歲，平均(52.07±2.37)歲。癌前病變組織組(50例)：均經病理診斷為低級別或高級別上皮內瘤變，男性22例，女性28例；年齡33～74歲，平均(53.11±3.05)歲。正常胃黏膜組織組(50例)：均經病理診斷為非萎縮性胃炎，男性25例，女性25例；年齡30～72歲，平均(52.69±2.91)歲。3組性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1組織樣本中BRD4、SSBP1及PCDH17蛋白檢測 將收集的組織標本用石蠟包埋，作連續切片(厚度4 mm左右)。應用免疫組織化學染色法測定組織標本中BRD4、SSBP1及PCDH17蛋白水平。石蠟切片經脫蠟、醇化后，應用檸檬酸鈉緩沖液高溫修復抗原，維持沸騰10 min后自然冷卻，滴加10%正常山羊血清封閉(37 ℃ 20 min)，加入一抗(BRD4抗體，1∶1 000稀釋，由Bethyl Laboratories公司提供；SSBP1抗體，1∶200稀釋，由Abcam公司提供；PCDH17，1∶500稀釋，由R&D Systems公司提供)，4 ℃過夜，次日加入對應二抗，恒溫箱孵育(37 ℃ 30 min)，DAB顯色，蘇木精復染，中性樹脂膠固；以磷酸鹽緩沖液替代一抗作為陰性對照。

1.2.2相關血清指標檢測 采集3組空腹靜脈血8 mL，經離心處理(1 500 r/min，15 min)后分離血清。血清癌抗原199( carbohydrate antigen,CA199)應用電化學發光法檢測，全自動電化學發光免疫分析儀購自羅氏公司，型號為E602；血清胃蛋白酶原(pepsinogen，PG)Ⅰ、PGⅡ、胃泌素17(gastrin-17,G-17)應用酶聯免疫吸附測定雙抗體夾心法檢測，試劑盒購自上海江萊生物科技公司；血清幽門螺桿菌(helicobacter pylori，HP)抗體應用膠體金法定性檢測，試劑盒購自珠海市銀科醫學工程公司。

1.3結果評價 由本院經驗豐富的病理科醫師進行雙盲法分析，在400倍光學顯微鏡下，選取10個高倍視野(每個視野100個細胞)，計算BRD4、SSBP1與PCDH17陽性細胞占同類細胞的比例。陰性(0分)：陽性細胞≤5% ，弱陽性(1分)：陽性細胞為5%～30%，中等陽性(2分)：陽性細胞為30%～60%，強陽性(3分)：陽性細胞>60% 。評分為1～3分均判定為陽性。BRD4陽性染色判斷標準：胞漿及細胞核內呈現棕黃色或棕褐色顆粒。SSBP1陽性染色判斷標準：細胞質內呈現棕黃色或棕褐色顆粒。PCDH17陽性染色判斷標準：細胞質內呈現黃色、棕黃色或褐色顆粒。

1.4統計學方法 應用SPSS 21.0統計軟件數據分析。計量資料采用t檢驗；計數資料采用χ2檢驗；等級資料比較用秩和檢驗；應用ROC曲線分析BRD4、SSBP1及PCDH17診斷早期胃癌的價值。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1組織樣本中BRD4、SSBP1及PCDH17的表達 胃癌組織中BRD4和SSBP1呈高表達，而PCDH17呈低表達。3組組織樣本中BRD4、SSBP1及PCDH17的陽性率比較差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 組織樣本中BRD4、SSBP1及PCDH17的表達STable 1 Expression of BRD4, SSBP1 and PCDH17 in tissue samples (n=50，例數)

2.2 3組血清指標分析 3組血清CA199、PGⅠ、PGⅡ、G-17水平及HP陽性率比較差異有統計學意義(P<0.05)；胃癌組織組患者血清CA199、PGⅠ、G-17水平及HP陽性率明顯高于癌前病變組織和正常胃黏膜組織組，而PGⅡ水平低于癌前病變組織和正常胃黏膜組織組(P<0.05)，見表2。

表2 3組血清指標分析Table 1 Analysis of serum indicators in three groups

2.3BRD4、SSBP1及PCDH17的表達與胃癌臨床特征的關系 不同性別、年齡、腫瘤直徑及分化程度的胃癌組織中BRD4、SSBP1、PCDH17的陽性率比較差異無統計學意義(P>0.05)；臨床分期為Ⅲ期～Ⅳ期、發生淋巴結轉移的胃癌組織中BRD4、SSBP1、PCDH17的陽性率比較差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 BRD4、SSBP1及PCDH17的表達與胃癌臨床特征的關系Table 3 Relationship between BRD4, SSBP1 and PCDH17 expression and clinical features of gastric cancer (n=50,例數，%)

表3 (續)

2.4ROC曲線分析 由ROC曲線分析可知，BRD4診斷胃癌的AUC為0.806(95%CI:0.811～0.913,P<0.05),診斷敏感度為85.62%，特異度為82.49%%；SSBP1診斷胃癌的AUC為0.759(95%CI:0.745～0.883,P<0.05),診斷敏感度為81.77%，特異度為76.83%；PCDH17診斷胃癌的AUC為0.703(95%CI:0.694～0.823,P<0.05),診斷敏感度為78.49%，特異度為72.62%；BRD4+SSBP1+PCDH17診斷胃癌的AUC為0.895(95%CI:0.867～0.998,P<0.05),診斷敏感度為89.46%，特異度為86.31%；結果提示，與單一指標比較，BRD4+SSBP1+PCDH17診斷的敏感度和特異度均較高，見圖1。

圖1 ROC曲線分析Figure 1 ROS curve analysis

3 討 論

胃癌為臨床常見的惡性腫瘤，盡管治療方式不斷改善，但患者預后仍不理想[8]。因此，探究胃癌發病機制，明確其早期診療靶標，對于胃癌的臨床診治意義重大。BRD4為BET家族成員之一，其與腫瘤的發生進展有關[9]。張華鵬[10]研究報道，BRD4在肝癌細胞中呈高表達,且其表達量隨疾病進展而升高，敲低BRD4可抑制肝癌細胞增殖。吳小秦等[11]學者研究報道，BRD4在喉鱗狀細胞癌腫瘤組織中呈高表達，可促進癌細胞轉移。SSBP1為一種同源四聚體，可參與線粒體DNA的復制、轉錄[12]。楊丹平等[13]學者提出，SSBP1在食管鱗狀細胞癌組織中表達上調，參與食管鱗癌的發生進展。PCDH17為一種單鏈跨膜蛋白，可介導細胞間黏附作用[14]。最近有文獻報道，PCDH17在多種腫瘤組織中呈低表達，其參與腫瘤的發生進展[15]。由以上研究可知，BRD4、SSBP1及PCDH17與惡性腫瘤有關，因此，本研究進一步探究了三者聯合診斷胃癌的臨床價值。

本研究顯示，3組組織樣本中BRD4、SSBP1及PCDH17的陽性率比較差異有統計學意義，胃癌組織中BRD4和SSBP1呈高表達，而PCDH17呈低表達。結果提示，BRD4和SSBP1可能對胃癌的發生起促進作用，PCDH17可能是潛在的抑癌基因。張竹等[16]學者研究發現，BRD4和SSBP1在早期胃癌組織中的陽性表達率較高，與胃癌前病變進展有關。朱春霞等[17]學者研究發現，PCDH17基因甲基化診斷胃癌的特異度較高，可用于胃癌早期篩查。本研究探究了胃癌與患者臨床特征的關系，發現臨床分期為Ⅲ期～Ⅳ期、發生淋巴結轉移的胃癌組織中BRD4、SSBP1、PCDH17的陽性率比較差異有統計學意義。結果提示，BRD4、SSBP1、PCDH17的表達與胃癌臨床分期、淋巴結轉移有關。究其原因可能為：①BRD4可能通過調控信號通路促進胃癌進展[18]；②SSBP1突變可誘導腫瘤組織中mtDNA的突變，當該突變積累到某種程度時，可引起腫瘤病變[19]；③PCDH17表達下調對組織的浸潤能力造成一定影響，還可對淋巴結黏附分子的運動造成一定影響，進而促使疾病進展[20]。本研究進一步采用ROC曲線分析發現，BRD4+SSBP1+PCDH17聯合診斷的敏感度和特異度均高于單一指標。結果提示，BRD4、SSBP1與PCDH17可作為胃癌早期診斷標志物。

本研究顯示，3組血清CA199、PGⅠ、PGⅡ、G-17水平及HP陽性率比較差異有統計學意義；胃癌組織組患者血清CA199、PGⅠ、G-17水平及HP陽性率明顯高于癌前病變組織和正常胃黏膜組織組，而PGⅡ水平低于癌前病變組織和正常胃黏膜組織組。CA199為糖類抗原，其是結直腸癌、胃癌等消化系統腫瘤標志物[21]。PG為胃黏膜分泌的產物，其在臨床胃癌的篩查中具有一定價值[22]。G-17可反映胃竇分泌功能，其在胃癌診斷和篩查中發揮重要作用[23]。HP是誘發胃癌的主要病原體，HP的毒力因子(CagA和VacA等)可促進胃癌的發生[24]。因此，檢測相關血清指標有利于臨床胃癌的輔助診斷。

綜上所述，聯合檢測BRD4、SSBP1與PCDH17，輔以相關血清指標，有利于臨床胃癌的鑒別診斷。