μ阿片受體羧基端375STANT379位點磷酸化對嗎啡鎮痛效果的影響

周筱慧 李笑妍 褚海辰 董銘心

(1 青島大學附屬醫院麻醉科，山東 青島 266003； 2 青島大學藥學院)

嗎啡作為經典的阿片類藥物在臨床上應用廣泛，是臨床最有效的鎮痛藥物之一[1-2]。伴隨著嗎啡的長期應用，受體脫敏、藥物耐受等副作用逐漸顯現，明顯降低了嗎啡的鎮痛效果，限制了其臨床應用[3]。阿片耐受和痛覺過敏的機制復雜，其中μ阿片受體(MOR)信號通路是關鍵環節[4]。既往研究發現，MOR羧基端存在諸多與嗎啡鎮痛活性及副作用相關的磷酸化位點。羧基端多位點磷酸化是促使MOR急性脫敏和長期耐受的關鍵因素，磷酸化位點缺失的MOR可增強阿片類藥物鎮痛作用[5]。基于此，本研究針對MOR羧基端關鍵磷酸化區域375STANT379，設計合成多肽，并通過競爭性干擾MOR羧基端關鍵位點磷酸化，探究受體375STANT379位點磷酸化對嗎啡鎮痛效果的影響，以期為開發可與嗎啡聯合應用以增強鎮痛作用的多肽類藥物提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

MOR質粒由上海聯慧腦智工程研究中心提供。HEK-293細胞購于北京中科質檢生物技術有限公司。CCK-8試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司。8周齡成年雌性C57BL/6JNifdc小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，所有小鼠先置于12 h/12 h晝夜環境中，溫度穩定在(23±2)℃，相對濕度60%，自由進食和飲水，7 d后進行后續實驗。

1.2 實驗方法

1.2.1多肽的設計 通過GenBank數據庫檢索并同時確認MOR的完整序列。針對關鍵磷酸化區域375STANT379氨基酸序列，設計多肽TAT-Q368-T379。為完整囊括關鍵磷酸化位點，多肽活性部分設計覆蓋MOR羧基末端368～379氨基酸序列(QNTREHPSTANT)；為使多肽能穿透多個生物膜進入細胞內發揮預期功效，多肽N端添加穿膜序列TAT(YGRKKRRQRRR)協助功能序列穿膜。

1.2.2多肽固相合成 采用標準多肽固相合成方法，將Fmoc保護氨基酸在Rink amide-MBHA Resin樹脂上逐步偶聯合成多肽。使用高效液相色譜(HPLC)在Posotisil C18半制備柱上對多肽進行純化，流動相條件設置為：水相為去離子水+體積分數0.000 5的三氟乙酸，有機相為乙腈+體積分數為0.000 5的三氟乙酸。采用HPLC檢測多肽純度，高分辨質譜法(HRMS-ESI)檢測多肽的相對分子質量，驗證無誤以后，將多肽凍干，置于-20 ℃條件下保存備用。

1.2.3細胞培養與轉染 HEK293細胞在含體積分數0.10胎牛血清(FBS)和體積分數0.01抗生素(100 000 U/L青霉素和100 μg鏈霉素)的DMEM培養基中培養，置于37 ℃、含體積分數0.05 CO2的培養箱中培養，隔天傳代。應用陽離子聚合物類轉染試劑sinofection將含有血凝素標記的MOR質粒(HA-MOR)轉染進入細胞。24 h后進行后續實驗。

1.2.4CCK-8法檢測多肽對細胞的毒性作用 將轉染完成的HEK-293細胞接種在96孔板中，每孔104個細胞，待24 h后細胞貼壁后，將細胞隨機分為A、B、C、D、E、F組，分別加入終濃度為0、0.5、1.0、10.0、50.0、100.0 μmol/L的多肽100 μL，孵育24 h后，每孔再加入10 μL CCK-8溶液繼續培養1 h。使用酶標儀測量波長450 nm處反應體系的吸光度。細胞存活率=[(實驗孔吸光度-空白孔吸光度)/(對照孔吸光度-空白孔吸光度)]×100%。每組設置6個復孔，結果取均值。

1.2.5熱板法檢測嗎啡鎮痛效果 將小鼠隨機分為A～F組，實驗前先測量小鼠體質量和基礎痛閾。C組小鼠右下腹腹腔注射5 mg/kg的TAT-Q368-T379，D、E、F組小鼠右下腹腹腔分別注射1、5、10 mg/kg的TAT-Q368-T379，自由活動1 h后，B、D、E、F組小鼠頸背部皮下注射嗎啡10 mg/kg，A組小鼠頸背部皮下注射生理鹽水10 mL/kg。各組小鼠分別于末次注射后15、30、45、60、90、120、150、180 min采用熱板法測定疼痛反應潛伏期，具體方法為：熱板儀保持(55±1)℃恒溫，將小鼠站立于熱板上，以小鼠接觸熱板到出現舔后足疼痛反應的時間記為疼痛反應潛伏期，作為痛閾指標。以5～30 s為篩選的閾值，以60 s為最大閾值，即小鼠60 s未出現疼痛反應即停止測量。計算嗎啡鎮痛反應率(MPE)，MPE=[(疼痛反應潛伏期-基礎痛閾)/(60-基礎痛閾)]×100%。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 TAT-Q368-T379多肽的設計與合成

A：結構式，B：HPLC測定結果，C：HRMS-ESI測定結果

2.2 多肽TAT-Q368-T379的細胞毒性檢測結果

CCK-8實驗結果顯示，A～F組的HEK-293細胞的存活率分別為(96.20±2.49)%、(102.03±4.07%)、(107.21±0.84)%、(106.63±7.53)%、(104.42±10.15)%、(100.02±16.49)%。Welch方差分析結果顯示，各組間細胞存活率比較差異無顯著性(P>0.05)。

2.3 多肽TAT-Q368-T379對嗎啡鎮痛效果影響

表1 GEE參數估計結果Tab.1 Parameter estimation results of GEE

當矯正組別效應與交互作用后，默認180 min(time=8)為參照組時，15 min(time=1)、30 min(time=2)、45 min(time=3)、60 min(time=4)、90 min(time=5)、120 min(time=6)、150 min(time=7)MPE的平均水平分別較180 min組高33.478%、59.299%、59.299%、59.299%、57.111%、50.928%、33.979%，差異均有統計學意義(Waldχ2=10.146～84.246，P<0.05),提示矯正不同干預措施的影響，不同時間小鼠MPE值不同。為進一步探究不同干預措施在不同時間對MPE影響的差異，進行簡單效應分析，P<0.05時差異具有統計學意義。簡單效應分析結果顯示，在給藥后60～180 min內，D、E、F組小鼠MPE值下降速度較B組明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。C組小鼠在給藥后MPE始終維持低水平，與A組相比，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 不同處理因素對嗎啡鎮痛效果的影響(χ/%)Tab.2 Effect of different treatment factors on the analgesic effect of morphine (χ/%)

3 討 論

嗎啡是臨床上治療各種急慢性疼痛的常用藥物，而伴隨嗎啡的長期應用，一系列副作用逐漸顯現，患者表現為受體脫敏、藥物耐受、藥物依賴、呼吸抑制、便秘等[6]。MOR是一種抑制性G蛋白偶聯受體，當嗎啡與MOR結合后，一方面通過G蛋白通路，抑制腺苷酸環化酶和cAMP的產生，降低電壓門控Ca2+通道電導，或打開內向整流K+通道，產生鎮痛活性[7]。另一方面各種激酶促使MOR磷酸化，招募下游Arrestin蛋白與受體結合，阻止G蛋白偶聯導致受體脫敏，同時促進受體內化。去磷酸化受體一部分進入循環返回質膜恢復活性，一部分進入溶酶體進行降解[8]。受體在細胞膜上表達降低可促進藥物耐受，降低鎮痛效率，因此，MOR磷酸化與嗎啡鎮痛效果存在密切關系。

MOR羧基末端具有多個絲氨酸、酪氨酸和蘇氨酸磷酸化位點[9]，各位點激活方式不同，而且在MOR激活后也會引起不同的生物學效應。LAU等[10]通過定量質譜聯合細胞生物學分析方法發現，375STANT379位點是阿片類藥物誘導MOR磷酸化的關鍵位點。阿片類藥物作用于MOR以后，介導Ser375位點發生快速且顯著的磷酸化，并隨后促進其他位點的磷酸化，其中包括Thr370、Thr379和Thr376[11-14]；DOLL等[15]開發的Ser375磷酸化抗體，進一步驗證了該位點磷酸化的重要作用。同時375STANT379位點磷酸化與β-arrestin-2蛋白招募及MOR內吞密切相關[10]。將375STANT379序列中所有絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)突變為丙氨酸(A)以后，β-arrestin-2蛋白招募與MOR內吞受到明顯抑制[14，16-17]。研究顯示，即使是375STANT379序列中單一位點的突變，也會顯著降低與β-arrestin-2蛋白招募相關的受體內吞[10]。受體內吞在受體脫敏及藥物耐受中起著關鍵作用[8，18]。以上生物學效應均在不同程度上對嗎啡鎮痛效果產生影響，為MOR羧基端375STANT379位點磷酸化與嗎啡鎮痛效果的關系的研究提供了線索。

由于位點敲除等手段在實際應用上存在困難，因此可以考慮通過藥物聯用改善嗎啡鎮痛效果。研究發現，目前有7 000多種天然多肽在人類生理中起到重要作用，并在機體內扮演著激素、神經遞質、生長因子、離子通道配體或抗感染藥物等角色[19-22]。同時，由于多肽藥物具有免疫原性低、組織滲透性好、易于合成和改造、安全性高、不易在組織中蓄積等優點，在抗腫瘤、抗菌及慢性代謝性疾病、心血管疾病、免疫疾病等的治療中應用廣泛[23]，是臨床常用的聯用藥物選擇。

本研究針對375STANT379關鍵磷酸化位點序列設計多肽TAT-Q368-T379，在多肽N端添加穿膜序列TAT，協助多肽穿膜抵達細胞內發揮生物學效應。應用標準固相合成方法合成多肽TAT-Q368-T379，操作簡便，且該多肽易于分離純化、損失小、收率高。HRMS-ESI結果顯示，多肽相對分子質量與預期值相符，HPLC結果顯示多肽純度大于96%，提示該多肽合成正確，可以應用于細胞與動物實驗。采用CCK-8法檢測出的多肽細胞毒性，經Welch方差分析法分析顯示各組間差異無統計學意義，提示TAT-Q368-T379安全范圍較大，不易產生細胞毒性。小鼠熱板實驗結果顯示，多肽預處理組小鼠嗎啡鎮痛作用時間較嗎啡組小鼠明顯延長，而單純多肽組小鼠未見明顯鎮痛作用，提示該多肽與嗎啡聯用可顯著延長嗎啡持續作用時間，增強了嗎啡鎮痛效果。結合既往研究結果進行分析，可以推測多肽進入細胞后通過競爭性抑制MOR磷酸化，阻止了β-arrestin-2蛋白募集及MOR內吞過程，抑制了受體脫敏及耐受等一系列副作用的產生，從而改善了嗎啡鎮痛效果。此機制尚可進一步應用β-arrestin-2蛋白募集實驗及受體內吞實驗進行驗證，同時可將多肽設計思路應用于其他關鍵位點作用的研究。

綜上所述，MOR羧基端375STANT379磷酸化區域與嗎啡鎮痛相關，本研究設計的多肽可作為工具競爭性抑制此關鍵位點磷酸化，從而有效增強嗎啡鎮痛效果。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

ConflictsofInterest： All authors disclose no relevant conflicts of interest.

倫理批準和動物權利聲明：本研究涉及的所有動物實驗均已通過青島大學醫學部倫理委員會的審核批準(文件號202007C57162202-111027)。所有實驗過程均遵照《實驗動物管理條例》的要求進行。

EthicsApprovalandAnimalRight： All experimental animal protocols in this study were reviewed and approved by The Medical Ethics Committee of Qingdao University Faculty of Medicine (Approval Letter No.202007C57162202-111027), and all experimental animal protocols were carried out by following the Animal Management Regulations.

作者貢獻：褚海辰、董銘心、周筱慧參與了研究設計；董銘心、周筱慧、李笑妍參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發表該論文。

Contributions： The study was designed byCHUHaichen,DONGMingxin, andZHOUXiaohui. The manuscript was drafted and revised byDONGMingxin,ZHOUXiaohui, andLIXiaoyan. All the authors have read the last version of the paper and consented submission.