腦心通膠囊對血管性癡呆大鼠乙酰膽堿能神經的影響※

孫康哲 曾建國

血管性癡呆（vascular dementia,VD）是一種以組織學損傷和進行性智力減退為特征的腦損傷，常由缺血缺氧性或出血性腦血管病變引發[1]。據統計，全世界有3600萬VD患者，并在將來相當長的一段時間內極可能呈顯著增長趨勢[2]。血管性因素逐漸成為老齡化人口中引發癡呆病變的高發因素，VD 逐漸成為繼阿爾茨海默病（Alzheimer's Disease，AD）后的第二種常見老年癡呆癥[3-4]。VD 是一種可治療的老年性癡呆，只要早期預防和干預可以就大大降低殘障的發生率，因此針對VD的研究具有重要的意義。

中藥膠囊及顆粒劑具有服用簡單、吸收好、攜帶方便等優點，被臨床廣泛使用。目前，常用于治療VD的中成藥有腦心通膠囊、養血清腦顆粒、銀杏葉片、腦復康膠囊、通心絡膠囊等[5]。腦心通膠囊組方源于清代王清任《醫林改錯·卷下·癱痿論》的補陽還五湯，在此基礎加蟲類藥和活血化瘀藥共16 味中藥組成[6]。大量臨床數據證實，腦心通膠囊對VD 等疾病具有良好的治療作用[7]。本實驗采用雙側頸總動脈反復缺血-再灌注(2VO)方法建立VD 大鼠模型，用腦心通膠囊干預治療，探討其對VD 大鼠認知功能障礙的改善作用以及對膽堿能神經環路的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組健康SPF 級雄性SD 大鼠48只（實驗動物許可證號：SCXKG2017-0002；質量合格證號：0017985），由廣西醫科大學實驗動物中心提供，體重范圍250～300 g，飼養條件為室溫(25±1)℃，濕度(50±10)%，明暗周期12 h，自由飲水和攝食。采用簡單隨機化分組法（計算機產生隨機數字）分為假手術(Sham)組、VD模型組、腦心通膠囊治療組、多奈哌齊陽性對照組，每組12 只。Y 迷宮實驗每組使用6 只，病理切片觀察每組使用3只，免疫組化每組使用3只。

1.2 實驗試劑與儀器腦心通膠囊（陜西步長制藥有限公司，國藥準字Z20025001，批號：170520）；膽堿乙酰轉移酶(ChAT)一抗(上海雅吉生物科技發展公司，批號：170430)；多奈哌齊(衛材中國藥業有限公司，國藥準字H 20050978，批號：1702080)；水合氯醛（陜西圣瑞醫藥科技有限公司，批號：170325）；Y 迷宮由廣西醫科大學第二附屬醫院自制；INTELSINT TP 300封閉式組織脫水機；Thermo Scientific HistoStar 組織包埋機；SLEE CUT 4062手動輪轉式切片機；上海精密儀器有限公司TEC 2500 病理組織漂烘儀；Leica TCSSP 8共聚焦顯微鏡等。

1.3 實驗方法

1.3.1 造模與給藥 VD 大鼠模型采用改良雙側頸總動脈反復缺血-再灌注(2VO)法[6]。主要方法如下:取健康雄性SD大鼠48只，適應性飼養7天，術前禁食禁水8 h，根據體重（350 mg/kg）使用3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉。除Sham 組外，其余各組采取2.5 mg/kg硝普鈉腹腔注射，隨即使用無創動脈夾夾閉雙側頸總動脈，夾閉10 min后松開10 min，反復操作5次，取出動脈夾及絲線，消毒皮膚，保溫飼養。為防止低溫對缺血性腦損傷的保護，整個造模過程中維持動物肛溫在37 °C左右。

各組大鼠造模后次日灌胃給藥，根據各組大鼠體重按劑量給藥，腦心通膠囊治療組（350 mg/kg）灌胃1次/d，多奈哌齊對照組（5 mg/kg）灌胃1 次/d，Sham 組和VD模型組用等容量生理鹽水灌胃，持續27 d。

1.3.2 空間記憶能力測試 采用Y迷宮實驗法在術后27 d 進行。每組取6 只大鼠從A 臂置入，使其在ABC 三個臂中自由活動8 min，記下大鼠在ABC 三個臂的穿梭次數（經過中心臂后且進入不同于上一次進入的臂，如ABC、ACB或CAB）。用選擇性穿梭的次數與總穿梭次數的比值（即自發交替率）來評估大鼠的空間記憶能力，比值越大，表明大鼠的空間記憶能力越好[9]。

1.3.3 病理切片觀察 每組取3 只大鼠使用蘇木精-伊紅（HE）染色法制作大鼠腦組織的病理切片[10]。連續給藥27 d 后，大鼠經麻醉后固定于自制的手術木板上，置于解剖盤中，開胸暴露并游離出心臟，切開右心房，經左心室插入灌流針并固定，分別用25 mL磷酸鹽緩沖液（PBS）和4%多聚甲醛灌流心臟。取腦后用4%多聚甲醛固定，1 d后用自動脫水機脫水，采用石蠟包埋后切片，選出海馬部位用HE法染色，置于光鏡下觀察CA1區形態學變化。

1.3.4 免疫組化法 每組取3 只大鼠根據體重（350 mg/kg）用水合氯醛腹腔注射麻醉，在心臟部位插入管道方向為左心室向升主動脈，先用150 mL 0.9%生理鹽水沖洗，隨后灌入300 mL 4%多聚甲醛在30 min內完成；取腦并將腦組織固定在4%多聚甲醛中10 h,隨后用30%的蔗糖-PBS 溶液和20%的蔗糖-多聚甲醛溶液處理直至下沉。選取視交叉后緣處腦組織，進行包埋、切片處理，然后用免疫組化法染色。在電鏡下觀測各組大鼠海馬CAl區ChAT蛋白的表達情況。

1.4 統計學分析采用SPSS 19.0 統計軟件進行數據分析，實驗數據以均數±標準差()表示，多組均數間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 空間記憶功能測試結果結果表明，VD模型組大鼠空間記憶能力顯著低于Sham 組（P＜0.05）。多奈哌齊陽性對照組、腦心通膠囊治療組空間記憶能力顯著高于VD模型組（P＜0.05）。各分組間大鼠在迷宮總進臂數量差異無統計學意義（P＞0.05），說明各組大鼠常規移動不受手術和口服藥物的影響。見表1。

表1 各組大鼠空間記憶能力情況

2.2 HE 染色的一般形態學觀察結果表明，Sham組海馬CA1區呈現結構清晰、分布均勻的多層排列的錐體細胞，神經細胞外形為圓形或橢圓形，顏色較淡，染色均勻為淡藍色或藍色；VD 模型組海馬CA1 區顯示排列稀疏、紊亂的錐體細胞，神經元細胞數量較少，呈固縮狀或顯示為極淡藍色或藍色消失，細胞間質成分呈顆粒狀分布，細胞內有空腔，細胞間隙增大；和VD模型組相比，多奈哌齊陽性對照組、腦心通膠囊治療組呈規則外形形態，細胞間隙比VD模型組小，空腔現象比VD模型組少。見圖1。

圖1 各組大鼠海馬CA1區HE染色情況（×100）

大鼠海馬CA1 區HE 染色中段細胞計數結果表明，與Sham 組對比，VD 模型組明顯下降(P＜0.05)，而腦心通膠囊治療組及多奈哌齊陽性對照組較VD模型組增多(P＜0.05)。見表2。

表2 各組大鼠海馬CA1區HE染色中段細胞數（）

表2 各組大鼠海馬CA1區HE染色中段細胞數（）

注：與Sham組相比，*P＜0.05；與VD模型組相比，#P＜0.05

2.3 免疫組化結果結果表明，與Sham 組對比，VD模型組ChAT陽性細胞數明顯下降(P＜0.01)，而腦心通膠囊治療組及多奈哌齊陽性對照組大鼠海馬CAl 區ChAT 陽性細胞數較VD 模型組增多(P＜0.05)。見圖2、表3。

表3 各組大鼠海馬CA1 區ChAT陽性細胞數（）

表3 各組大鼠海馬CA1 區ChAT陽性細胞數（）

注：與Sham組相比，*P＜0.01；與VD模型組相比，#P＜0.05

圖2 各組大鼠海馬CA1區免疫組化法染色情況（×400）

3 討論

反復腦缺血-再灌注損傷是導致VD 的病理生理學基礎，本次研究制備VD 大鼠模型采用的是經改良的雙側頸總動脈反復缺血-再灌注(2VO)法。術后大鼠均出現明顯的認知功能障礙，HE 染色提示，VD 模型組大鼠海馬CA1區中段細胞數顯著下降，神經元受損，同時免疫組化結果說明造模大鼠中樞膽堿能神經環路中ChAT蛋白顯著降低。

在對VD 病理機制的研究中，乙酰膽堿能系統對大腦的認知學習功能起到重要作用。神經系統中最重要的神經遞質便是在膽堿乙酰轉移酶（ChAT）的作用下由乙酰輔酶A 和膽堿合成的乙酰膽堿（Ach），其主要作用是傳遞神經沖動。乙酰膽堿能環路主要由Ach、乙酰膽堿酯酶、ChAT三部分組成，其總體狀況直接決定著癡呆的病發、嚴重程度和病程[11-12]。相關研究表明[13]，海馬CA1 區損傷的嚴重程度決定著VD 學習、記憶等相關功能的損害。膽堿能神經環路的活性主要由乙酰膽堿酯酶(AChE)、乙酰膽堿受體(AChR)、膽堿乙酰基轉移酶(ChAT)、囊泡乙酰膽堿轉運體(VAChT)等物質決定。ChAT 由于穩定性高且僅存在于膽堿能神經元內而被廣泛認為是膽堿能神經元活性狀態的最佳標志物[14-15]。

腦心通膠囊在臨床上被廣泛用于治療心腦血管疾病，是基于古方補陽還五湯增加了蟲類藥、活血化瘀藥制成的復方中藥制劑[16]。據報道，腦心通膠囊有可增強大腦血氧供應,保護腦細胞,對VD患者學習、認知功能、判斷和思維能力起到改善作用[17-20]。從組織病理學和免疫組化結果來看，腦心通膠囊治療組大鼠海馬CA1區的中段細胞水平和ChAT陽性細胞數顯著高于VD模型組，鑒于ChAT被廣泛認為是膽堿能神經元活性狀態的最佳標志物，因此判斷腦心通膠囊有上調膽堿能神經環路的功能。

本研究采用長效的中樞乙酰膽堿酯酶抑制劑(AchEI)多奈哌齊作為陽性藥。其主要通過選擇性抑制乙酰膽堿的降解，增大神經元突觸間隙乙酰膽堿的濃度，使VD癥狀得到改善。大量實驗結果證實，多奈哌齊可明顯改善VD 患者在認知、智能以及日常生活能力的狀態，且很少產生不良的外周反應[21-23]。通過本研究發現，腦心通膠囊在改善大鼠空間記憶能力及調節大鼠膽堿能神經環路ChAT蛋白的表達方面效果相當。

本研究結果表明，腦心通膠囊在VD 大鼠膽堿能神經環路ChAT 蛋白的表達方面有調控作用，能有效改善其他記憶能力。但是，本次研究仍存在不足之處，如未對其他膽堿能神經蛋白進行考察，沒有從基因層面明確腦心通膠囊對ChAT基因啟動子的調控作用，可在以后的研究中逐步完善。