禽流感病毒溯源

文│王志生 尤東峰 孫振洲（吉林省東豐縣農(nóng)業(yè)綜合執(zhí)法大隊） 李海博（東豐縣梅花鹿產(chǎn)業(yè)發(fā)展服務公司）

流行性感冒病毒（influenza virus）是正粘病毒科（Orthomyxoviridae）的代表，簡稱流感病毒。以人、豬、馬及各種家禽和野生禽類為自然宿主，海豹或水貂等其他動物也有罹患流感的情況，但這些動物作為自然宿主的結論還未特別明確。人和哺乳動物的流感一般呈急性呼吸道疾癥狀，但禽流感從隱性感染到急性致死性發(fā)病都有出現(xiàn)，癥狀變化范圍廣。A型流感病毒雖然分布于包括人在內(nèi)的哺乳動物及禽類，但B型流感病毒和C型流感病毒感染只限于人。近年來，禽流感病毒已引起人們的高度重視，除了經(jīng)濟因素外，認為其對人的新型流感株可能有提供遺傳因子的重要作用。同時具有人流感病毒表面抗原和禽類病毒內(nèi)部蛋白的重組病毒是對猴子有免疫源性的弱毒，表明利用禽流感病毒遺傳因子的重組來建立弱毒活苗株是可能的。

一、病毒溯源

有關禽流感病毒最早記載是1878年報告在意大利發(fā)生的雞瘟（FP），根據(jù)雞瘟病原體有濾過性而認為是病毒。研究證明，雞瘟病毒具有A型流感病毒內(nèi)部的蛋白抗原，并首次表明雞瘟病毒（FPV）是流感病毒。由雞瘟引起的雞和火雞感染在世界各地屢見不鮮，1924～1926年在日本發(fā)生過雞瘟，后來明確了病原與古典的FPV相同。1949年，德國從雞瘟病雞體內(nèi)分離出N病毒，因雞的死亡率僅為20%，故認為是FP的弱毒變異株。1960年證明了N病毒是A型流感病毒，1952年加拿大從有神經(jīng)癥狀的鴨雛中分離到能凝集紅細胞濾過性病毒，后來確定為A型流感病毒。1983年，美國賓夕法尼亞州的雞群發(fā)生禽流感大流行。認為這次流行的病毒可能是由野鴨傳入。這對進一步理解流感病毒的病源性和生態(tài)現(xiàn)象具有重要意義。

在美國賓夕法尼亞州初期流行的雞群中，從病雞氣管內(nèi)分離到的流感病毒鑒定為A型H5N2亞型，這時病雞的癥狀輕微，將分離的病毒接種給健康雞只未見發(fā)病，而且病毒抗原亞型也與已知的古典FPV的H7N7或H7N1不同。但經(jīng)過一段時間，病毒病原性突然增強，病勢趨于嚴重，30%以上的雞冠腫脹壞死，并呈神經(jīng)癥狀，于2～3天內(nèi)死亡。這些癥狀和經(jīng)過與古典雞瘟相同。從死雞實質臟器、雞舍內(nèi)塵埃和蒼蠅體表均可分離到H5N2病毒，這次流感也擴散到兩個相鄰的州。據(jù)估計，這次流行造成的損失總額達到6000萬美元。這次流行到1984年2月才得到控制，至同年6月病毒及抗體檢查才全部轉換為陰性。在這次流行中初期毒力很弱的H5N2病毒，如何獲得強的病原性問題，科研人員將1983年4月分離的病毒和10月分離的強毒株RNA通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）進行比較，因為兩者8個片段的遷移率沒有差異，認為其沒有與其他病毒發(fā)生基因重組。接著研究了兩種病毒HA（血凝素）的氨基酸排列發(fā)現(xiàn)有少許發(fā)生了轉換，其中，認為在HA三維結構上，在靠近HA1和HA2斷裂處的第23號氨基酸發(fā)生交換。也就是說原始株HA有糖鏈附著，而強毒株則由于氨基酸的交換缺乏糖鏈。實際上強HA糖蛋白的聚丙烯酰胺瓊脂電泳遷移比較快，就是因為與弱毒株相比，缺少一個糖鏈的緣故。流感病毒的病原性和其HA的斷裂具有密切關系。在本次流行中，弱毒株HA的鄰裂部位因被糖鏈所覆蓋，細胞內(nèi)不能使其發(fā)生斷裂，但強毒株的這個部位是裸露的，可以發(fā)生斷裂。因此，糖鏈有抑制酶的作用，此種變異對病毒的毒力有很大影響，這應予以關注。

雞、鴨、鵝、鴿子、珍珠雞、鵪鶉等陸禽和水禽都會感染發(fā)病，但以火雞和雞最為易感，發(fā)病率和死亡率均較高，其中鴨和鵝等水禽可隱性感染或攜帶病毒，有時也會大量死亡。各日齡的雞和火雞均可感染，水禽幼雛死亡率較高。

二、易感種類

流感病毒不僅分布在家禽和觀賞鳥中，而且也廣泛分布于野禽中。1961年南非發(fā)生了大量燕鷗死亡，研究人員從其尸體中分離到流感病毒。在澳大利亞東海岸某無人島的健康海鷗氣管內(nèi)分離到H6N5。在美國西海岸被擊落的2000只野鴨和34只鴨的氣管及泄殖腔中分別分離到41株及7組HA亞型的流感病毒。分離到病毒的野鴨達9種之多。此后，世界各地從健康野鴨泄殖腔、腸管乳劑或糞便中均分離到大量的流感病毒。從野鴨分離的這些流感病毒均涉及紅細胞凝集素和神經(jīng)氨酸酶的抗原亞型，幾乎包含兩種抗原型和所有組合型。實驗感染證明，來自野鴨及虎皮鸚鵡的毒株都能在鴨腸管內(nèi)增殖，經(jīng)1～3周隨糞便排出，毒株在4～6天達最高值，相當于10000000EID50。

將野鴨病毒給家鴨靜脈接種時，同口腔或鼻腔接種一樣，病毒均在腸管內(nèi)增殖。鴨體內(nèi)增殖部位是大腸，特別是結腸。熒光抗體法證明，結腸形成隱窩的單層圓柱上皮細胞是主要靶向細胞。糞便內(nèi)的病毒在4℃下感染性能保持30天，在20℃時至少能保持7天。因此，在野鴨棲息的湖岸邊和水里有大量流感病毒，從湖沼岸邊的水禽糞便和水中分離到流感病毒就能證明有水源傳播的可能。

科研人員將野鴨泄殖腔試紙樣品在抗體存在下進行鴨體替代來分離病毒，結果在300個樣品中有19例分離到2個亞型病毒，2例分離到3個亞型病毒，表明在自然界中有混合感染的可能。

不同禽類感染禽流感的概率不同，但目前尚未發(fā)現(xiàn)高致病禽流感的發(fā)生與禽的性別有關，不過高致病性禽流感病毒也可通過禽蛋傳播。世界衛(wèi)生組織（WHO）認為，病禽糞便是傳播的主要渠道，候鳥遷移也是傳播的主要途徑。

三、毒株變異

1.抗原變異，即或HA亞型相同，其抗原性也有顯著差異。早期科研人員在研究中應用H4流感病毒的HA單位克隆抗體，對從世界各地收集的25株H4流感病毒的抗原進行檢查。根據(jù)反應類型可將這些病毒分成4群。其群別與宿主鳥的種類有關，與分離的年份無關。另外，DK/Czeh/56和DK/Hokkaibo/6/80雖是相隔24年分離到的病毒，但其與單克隆抗體的反應類型完全相同，說明兩者的HA抗原性非常接近。結果表明，即或是同一類型，之所以得到HA抗原性不同的變異病毒，是由于它們分布在禽類之間的緣故，似乎不是來源于某種特定的病毒所引起的抗原漂移。

早期科研人員應用抗H3病毒HA的單克隆單抗體對1977年及1980年北海道從野鴨分離到的H3N2及H3N8病毒的HA抗原性進行檢查，結果證明他們相互極為近緣。

2.與抗體的相互作用。用單克隆抗體證明了每個HA分子上存在3～4個非重復抗原決定簇。抗原決定簇的數(shù)量與人的H3HA相同。在任何抗HA單克隆抗體中，雖不能抑制同源病毒的紅細胞凝集作用，但含有中和感染性的物質。

3.近年發(fā)生的高致病禽流感毒力較強，可引發(fā)IV型變態(tài)反應，是導致進行性肺炎、急性呼吸道窘迫綜合征（ARDS）和多器官功能性障礙綜合征（MODS）等并發(fā)癥的根本原因。研究結果表明，高致病性禽流感病毒主要通過空氣傳染，借助病毒表面的血凝素（H），與呼吸道黏膜上皮細胞的核蛋白結合，在核內(nèi)組成RNA型可溶性抗原，并滲出至胞質周圍，復制子代病毒，通過神經(jīng)氨酸作用，用出芽方式排出上皮細胞。一個復制周期為4～6小時，排出的病毒擴散至附近細胞，產(chǎn)生炎癥反應，臨床上出現(xiàn)發(fā)熱、肌肉痛和白細胞降低等全身毒血癥樣反應。

四、傳播途徑

流感病毒可在不同禽種之間傳播是很明確的。自然條件下，病毒在禽與豬之間也可能發(fā)生傳播。1979年12月，美國馬薩諸塞州發(fā)現(xiàn)了許多死亡海豹，病例到1980年1月達到頂峰，病理剖檢結果顯示，肺有嚴重實質性病變，死亡海豹數(shù)500頭，死亡率約為20%。從死亡海豹的內(nèi)臟中分離到了流感病毒，經(jīng)鑒定，其抗原與A/FPV/Dutch/27（H7N7）為同一亞型。分離病毒的抗原體性、核酸和核酸產(chǎn)物上的結構蛋白都與各種禽類流感病毒極為相似。暗示鳥類流感病毒有直接感染人或其他哺乳動物的能力，并可能引起流行。

從1982年6月到1983年3月，在美國馬薩諸塞州的海豹再次發(fā)生流感，分離到的病毒為H4N5抗原亞型，與以前的流行無關。研究人員認為，禽類流感病毒對海豹的傳播是在自然狀態(tài)下發(fā)生的，也許是人或動物的新型流感病毒株出現(xiàn)的前驅階段。

2020年英國一場不同尋常的禽流感疫情導致一家野生動物康復中心的5只天鵝、3只海豹和1只狐貍死亡。在這個案例中，兩種不同的哺乳動物被感染，并發(fā)展成嚴重的疾病。研究人員發(fā)現(xiàn)，在死去天鵝、海豹及狐貍的檢驗樣本中均檢測出H5N8，是禽流感毒株H5N8的一個突變，可能是病毒從鳥類傳染到哺乳動物的原因。

中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所國家禽流感參考實驗室在H7N9禽流感病毒適應哺乳動物宿主機制研究方面取得重要進展，相關研究成果以“Low polymerase activity attributed to PA drives the acquisition of the PB2 E627K mutation of H7N9avian influenza virus in mammals”為題于6月18日在線發(fā)表于美國微生物學會（ASM）旗下頂級刊物。

禽流感病毒需要獲得哺乳動物適應性突變后才能在人體內(nèi)有效復制和傳播。早在1993年，美國科學家就發(fā)現(xiàn)，流感病毒在哺乳動物細胞中復制時會在病毒聚合酶蛋白PB2上發(fā)生E627K突變，但該突變產(chǎn)生的機制26年來一直是未解之謎。自2013年H7N9流感病毒在我國出現(xiàn)后，已造成1568人感染，死亡率接近40%。前期研究發(fā)現(xiàn)，PB2/E627K突變是H7N9流感病毒對人致病力增強的關鍵，同時該突變增加了H7N9病毒在人之間的傳播能力。

五、病源性

因為病原性或毒力是由宿主和病毒的相互條件決定的，禽類流感病毒有從被感染宿主不表現(xiàn)癥狀的弱毒到引起突然死亡的強毒，毒力參差不同，因此，病原性的研究在早期幾乎都用禽類流感病毒來進行。關于感染性、病原性或神經(jīng)毒性的研究表明，一些基因發(fā)生重組，斷裂成HA1及HA2是感染性進一步發(fā)揮毒力所必要的。科研人員在細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中證實了決定宿主范圍的是P3基因，而WSN株對小白鼠的神經(jīng)毒性，NA、M和NS 3種基因都是必需的。雞能發(fā)揮病原性的重組病毒，在雞體溫41℃時，具有良好的增殖性質，此性質是由聚合酶基因編碼的。

研究過程中還曾注意過在野鴨腸道內(nèi)增殖的病毒，其中一組來源于人毒株的HA，另外7株基因片段來源于野鴨株的重組體，8株中7株不能在野鴨腸道內(nèi)增殖。在鴨腸道內(nèi)增殖的病毒的HA抗原性發(fā)生了變異，檢查這種變異病毒的HA基因堿基排列，發(fā)現(xiàn)氨基酸排列的第226號和第228號位置發(fā)生變異。發(fā)生變異的場所是受體結合部位。因此，在此系統(tǒng)中，在腸道內(nèi)增殖的組織親和特性依賴于受體結合部位，也就是說依賴于受體的特異性。現(xiàn)已證實，像這種變異即使在自然條件下也會發(fā)生 。

六、治療

自2013年以來，H7N9亞型流感病毒在我國連續(xù)引起5波人H7N9疫情，共造成1564人感染，其中615人死亡，引起全球高度關注。疫情期間，人們由于恐懼而拒絕食用禽肉及禽蛋，致使大量禽產(chǎn)品被銷毀，每年給養(yǎng)禽業(yè)造成600～800億人民幣的經(jīng)濟損失。同時，H5亞型禽流感病毒持續(xù)對我國家禽養(yǎng)殖業(yè)構成威脅。該團隊圍繞我國H7N9及H5亞型禽流感防控的國家重大需求，在科學認知H7N9病毒和有效防控H7及H5亞型高致病性禽流感中取得了重大研究成果。

2021年，中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所動物流感基礎與防控研究創(chuàng)新團隊首席科學家陳化蘭院士領銜的“重組禽流感病毒（H5＋H7）滅活疫苗的創(chuàng)制及應用”的研究成果獲2021年度黑龍江省科學技術進步一等獎。揭示了H7N9病毒遺傳演化和生物學進化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)高致病性H7N9病毒對人具有更大危害，為我國H7N9流感防控政策的制定提供重要科學依據(jù)；創(chuàng)制出“一次免疫”可同時防控H5和H7亞型禽流感的反向遺傳學滅活疫苗，居世界領先水平，獲得國家一類新獸藥證書，及時推向應用并適時更新疫苗種毒。相關研究結果在《CellResearch》（IF＝25.617）、《Cell Host &Microbe》（IF＝21.023）和《SCIENCE CHINA Life Sciences》（IF＝6.038）等期刊發(fā)表。截至2020年年底，創(chuàng)制的疫苗在家禽中累計應用超過480億羽份，滿足了我國高致病性禽流感的防控重大需求，有力保障了家禽業(yè)健康發(fā)展，新增總經(jīng)濟效益2229億元人民幣，并成功從家禽源頭阻斷了人感染H7N9病毒的可能，產(chǎn)生巨大的社會效益。

七、結語

禽流感不斷在世界各地流行，嚴重影響了禽類安全。綜上所述，了解禽流感感染概率、傳播渠道、毒株變異、疫苗研制等極其重要，有效防控有利于阻斷禽流感的大流行，可增加經(jīng)濟效益。