應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測白芍抗血吸蟲病及肝纖維化的作用機制

楊 璽，李 彬，劉如愛，王播勇，楊 娜，馬運敏，肖朝江，姜 北，熊 偉，，*

（1.大理大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 大理 671000；2.云南省高校臨床生物化學(xué)檢驗重點實驗室，云南 大理 671000；3.云南省滇西抗病原植物資源篩選研究重點實驗室，云南 大理 671000）

全世界約有2.4億人感染血吸蟲病，肝血吸蟲病的主要病理改變是肝肉芽腫和蟲卵纖維化進而導(dǎo)致肝纖維化［1］。肝纖維化是由于多種慢性肝損傷引起的異常創(chuàng)面修復(fù)反應(yīng)，其特征為彌漫性細胞外基質(zhì)過度沉積和結(jié)締組織異常增生，可進一步發(fā)展為肝硬化、肝功能衰竭或肝癌［2］。肝纖維化引起的門脈高壓和腹水通常是慢性肝血吸蟲病患者死亡的主要原因［3］，肝纖維化是一個可逆轉(zhuǎn)的過程，只要肝臟不是處于晚期肝硬化階段，經(jīng)過積極的治療，清除引起纖維化反應(yīng)的物質(zhì)有助于纖維化的消退［4］。白芍（Paeonia lactifloraPall，PRA）是毛茛科芍藥屬植物的根，廣泛用于治療肝病［5］。芍藥苷（Paeoniflorin，PF）是PRA的主要活性成分，可以抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的活性和蛋白質(zhì)表達水平，減少IL-8的產(chǎn)生，從而發(fā)揮保心保肝作用［6］。但白芍治療肝纖維化的具體作用機制尚不清楚。近年來網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)越來越多地應(yīng)用于研究生物活性化合物與疾病靶點之間的相互作用［7］。本研究將運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法預(yù)測白芍抗血吸蟲病及肝纖維化的主要化學(xué)成分、靶點及作用機制，為白芍的臨床應(yīng)用以及血吸蟲病和肝纖維化的基礎(chǔ)與臨床研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 白芍中有效成分的篩選使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，http//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），以“白芍”為關(guān)鍵詞，以口服生物利用度（OB）≥30%和藥物相似性（DL）≥0.18作為候選化合物的篩選標準，篩選白芍的關(guān)鍵活性成分。同時點擊“Related Targets”選項，獲取其活性成分的有效靶點。通過Perl腳本利用UniProt數(shù)據(jù)庫（http：//www.uniprot.org/）對篩選出的有效靶點進行基因名注釋。

1.2 獲取白芍、血吸蟲病及肝纖維化的共同靶點基因以“schistosomiasis”和“l(fā)iver fibrosis”為關(guān) 鍵 詞 在GeneCards（https：//www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫中檢索血吸蟲病和肝纖維化對應(yīng)的靶點基因，分別與白芍預(yù)測靶點基因進行匹配，通過在線工具Draw Venn Diagram（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）得到共同靶點韋恩圖。

1.3 藥物—成分—靶點—疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將白芍、白芍有效成分、白芍靶點基因、白芍和血吸蟲病及肝纖維化共同靶點基因用Perl軟件進行映射，通過Cytoscape3.8.2軟件（http：//www.cytoscape.org/）構(gòu)建白芍抗血吸蟲病及肝纖維化的藥物—成分—靶點—疾病網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 白芍抗血吸蟲病及肝纖維化PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及關(guān)鍵靶點的篩選將白芍抗血吸蟲病及肝纖維化的靶點基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），物種設(shè)置為“Homo sapiens”，設(shè)置combined score＞0.4并隱藏游離點，利用R語言處理所得tsv文件，得到蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)核心靶點基因的條形圖。

1.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析通過在R語言中安裝org.Hs.eg.db包、clusterProfiler包、ggplot 2包、dplyr包和DOSE包，導(dǎo)入白芍抗血吸蟲病及肝纖維化相關(guān)靶點，進行GO功能富集分析及KEGG通路富集分析和可視化展示，得到白芍抗血吸蟲病及肝纖維化的生物學(xué)過程（Biological process），分子功能（Molecular founction）和細胞組成（Cellular component）以及潛在信號通路信息。

2 結(jié)果

2.1 白芍中有效成分的篩選結(jié)果通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索白芍的有效成分，基于OB≥30%且DL≥0.18的條件篩選出白芍主要有效成分13種（表1），提示這13種成分是白芍的重要活性成分。

表1 白芍活性成分篩選結(jié)果Table 1 Screening of active components of Paeonia lactiflora Pall

2.2 白芍抗血吸蟲病及肝纖維化作用靶點的預(yù)測結(jié)果使用GeneCards數(shù)據(jù)庫查找血吸蟲病及肝纖維化相應(yīng)的基因靶點，與白芍有效成分基因靶點進行匹配，通過在線工具Draw Venn Diagram得到16個活性成分-疾病共同靶點，分別是PTGS2、BCL2、BAX、JUN、NOS2、ACHE、MMP1、CYP3A4、CYP1A2、ICAM1、SELE、VCAM1、GSTP1、INSR、GSTM1、CAT（圖1）。

圖1 白芍與血吸蟲病及肝纖維化靶點交集的韋恩圖Fig.1 Venn diagram of target intersection of Paeonia lactiflora Pall with schistosomiasis and liver fibrosis

2.3 藥物—成分—靶點—疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果為了進一步了解化合物與相應(yīng)靶標之間的相互作用關(guān)系，將得到的有效活性成分和交集靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2中進行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，得到“藥物—成分—靶點—疾病”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。網(wǎng)絡(luò)包含21個結(jié)點和40條邊（圖2）。其中，菱形圖標為疾病，圓形圖標為交集靶點，三角形圖標為藥物，V形圖標為活性成分。通過將3種化合物匹配到16個潛在靶點，可以看出與關(guān)鍵靶點連接的成分主要有山奈酚、β-谷甾醇以及兒茶素，說明這三種成分可能在白芍抗血吸蟲病及肝纖維化中起重要作用。

圖2 藥物—成分—靶點—疾病網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Drug-component-target-disease network

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點的篩選結(jié)果為了進一步說明16個白芍抗血吸蟲病及肝纖維化共同靶點之間的相互作用，將16個與白芍抗血吸蟲病及肝纖維化相關(guān)的潛在基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫得到共同靶點基因編碼蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（圖3）。利用R語言處理STRING數(shù)據(jù)庫所得tsv文件，得到蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)相關(guān)核心基因的條形圖，同時獲得核心靶點基因名稱（圖4）。可以看出，JUN、PTGS2和CAT等基因可能是重要的靶點。

圖3 白芍抗血吸蟲病及肝纖維化靶點的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Protein-protein interaction network of targets of Paeonia lactiflora Pall against schistosomiasis and liver fibrosis

圖4 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)核心基因條形圖Fig.4 The bar diagram of core genes of the protein-protein interaction network

2.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析結(jié)果通過對白芍抗血吸蟲病及肝纖維化共同靶點進行GO和KEGG富集分析，GO富集分析顯示16個共同靶點在生物過程（BP）方面主要包括活性氧代謝過程、脂多糖的反應(yīng)、脂肪酸合成代謝以及對細菌來源分子的反應(yīng)和藥物反應(yīng)等；細胞組成（CC）主要涉及核被膜、細胞器外膜、膜筏以及膜微結(jié)構(gòu)域等；分子功能（MF）主要涉及血紅素結(jié)合，四吡咯結(jié)合、多肽結(jié)合、酰胺結(jié)合以及氧化還原酶和過氧化物酶活性等（圖5）。KEGG富集分析顯示16個共同靶點主要參與脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、細胞色素P450對藥物的代謝作用、小細胞肺癌、NF-kappa B信號通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染等信號通路（圖6）。

圖5 GO功能富集分析Fig.5 GO functional enrichment analysis

圖6 KEGG通路富集分析Fig.6 KEGG pathway enrichment analysis

3 討論

肝纖維化是由病毒感染、血吸蟲病和酒精中毒等多種因素引起的慢性肝損傷，但其確切的病理機制尚不清楚［8］。雖然多種藥物在體外細胞和動物模型中顯示具有抗纖維化活性，但臨床上迄今為止還沒有有效的抗肝纖維化治療的藥物。有研究表明，白芍中的白芍總苷具有多種保肝作用［9］，并且其中的有效成分芍藥苷對曼氏血吸蟲誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化具有一定的緩解作用［10］，但是其具體的分子機制尚不清楚。因此，篩選和確定白芍抗血吸蟲病及肝纖維化的治療靶點十分重要。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法篩選出山奈酚、β-谷甾醇以及兒茶素是白芍中發(fā)揮藥效的潛在活性成分。山奈酚通過下調(diào)IL-13和COL1基因表達，抑制膠原蛋白合成，同時上調(diào)MMP-2基因表達而促進膠原分解，發(fā)揮治療血吸蟲肝纖維化的作用［11］。肝纖維化與膠原蛋白和α-SMA表達水平的升高密切相關(guān)，β-谷甾醇能夠下調(diào)活化的肝星狀細胞中膠原-1和α-SMA的mRNA水平和蛋白質(zhì)表達水平，口服β-谷甾醇能有效緩解肝纖維化模型小鼠的肝損傷并且防止膠原積累［12］，這種調(diào)節(jié)作用表明該藥物可能是一種潛在的肝纖維化治療藥物。乙型肝炎和丙型肝炎是發(fā)生在肝臟最常見的病毒性疾病，它們會引起廣泛的炎癥并導(dǎo)致肝損傷。兒茶素及其衍生物對人類免疫缺陷病毒、單純皰疹病毒、流感病毒、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒等多種病毒具有抗病毒活性［13］，提示其對嗜肝病毒具有抗感染潛力。蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)核心基因條形圖表明，JUN、PTGS2和CAT等連接度高的基因靶點可能是白芍抗血吸蟲病及肝纖維化的重要靶點。有研究報道，抑制GSK-3β能夠誘導(dǎo)JUN的激活從而上調(diào)骨橋蛋白的表達，加速了慢性肝病患者膽汁淤積性肝纖維化的進展［14］。PTGS2負責前列腺素生物合成，參與炎癥和有絲分裂，PTGS2可能還與NF-kappa B信號通路的激活有關(guān)［15］，并且PTGS2是非甾體類抗炎藥物的重要靶點，下調(diào)PTGS2的表達有助于減少炎癥反應(yīng)［16］。CAT基因編碼過氧化氫酶，過氧化氫酶是人體抵御氧化應(yīng)激的關(guān)鍵抗氧化酶［17］。肝纖維化會逐漸導(dǎo)致抗氧化成分（過氧化氫酶）的減少和氧化應(yīng)激的增加，提高抗氧化分子（過氧化氫酶）表達能夠改善肝纖維化［18］。

GO富集分析顯示，白芍抗血吸蟲病及肝纖維化的16個靶點主要參與活性氧代謝過程，脂多糖的反應(yīng)，藥物反應(yīng)以及酶活性等。KEGG富集分析顯示16個靶點主要參與脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、糖尿病及其并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、細胞色素P450對藥物的代謝作用、小細胞肺癌、NF-kappa B信號通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染等信號通路。此外，這些靶標也富集在一些癌癥和病毒感染信號通路，如小細胞肺癌和卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染，這可能是因為一些癌癥和病毒感染與肝纖維化具有相同的信號通路。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的思路和方法，充分展現(xiàn)了白芍通過多靶點、多成分、多通路發(fā)揮抗肝纖維化及血吸蟲病的作用機制，為深入探討白芍抗血吸蟲病及肝纖維化的藥理機制提供了新的方向與線索。但本研究中發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵靶點和通路仍需要進一步通過實驗進行驗證和探究。