茶樹全基因組生長素反應因子（ARF）基因家族鑒定及表達分析

田時雨 張蓓林 雷陽 封聞 呂立堂

摘要：生長素反應因子（Auxin response factor）作為調控生長素應答基因表達的轉錄因子，對調控植物生長發育起著十分重要的作用。研究結合茶樹基因組數據，使用生物信息學分析，共鑒定出25個ARF基因，并將其命名為CsARF1～CsARF25。可將它劃分入5個亞族，同一亞族內的基序和保守結構域相對保守。通過對CsARF順勢作用元件的分析，發現其可能參與茶樹對逆境脅迫的響應和調控茶樹的生長發育。通過轉錄組基因表達情況分析，CsARF在茶樹不同組織的表達情況有很大區別，從一定程度上說明了CsARF參與調控茶樹的生長發育，qRT-PCR驗證分析結果趨勢與轉錄組數據基本一致，也從側面驗證了這一結果。研究結果可為茶樹ARF基因家族的進一步研究提供理論依據和參考。

關鍵詞：茶樹;ARF基因家族;基因表達分析

Identification and Expression Analysis of

Auxin Response Factor （ARF） Gene Family in

Tea Plants （Camellia sinensis）

TIAN Shiyu1，2， ZHANG Beilin3， LEI Yang1， FENG Wen4， L? Litang2*

1. Guizhou Vocational College of Agriculture， Guiyang 551499， China; 2. College of Tea Science， Guizhou University，

Guiyang 550025， China; 3. Guizhou Polytechnic of Construction， Guiyang 551400， China;

4. Quzhou Lüfeng Industry and Trade Co.， Ltd.， Quzhou 324000， China

Abstract： As a transcription factor that regulates the expression of auxin response genes， auxin response factor （ARF）plays a very important role in regulating plant growth and development. In this study， combining the tea genome data and bioinformatics analysis， a total of 25 ARF genes were identified and named CsARF1-CsARF25 respectively. They could be divided into 5 subfamilies， and the motifs and conserved domains in the same subfamilies are relatively conservative. Through the analysis of the homeopathic elements of CsARFs， it was found that they may participate in the response of tea plants to stresses and regulate the growth and development of tea plants. Through transcriptome gene expression analysis， the expressions of CsARFs in different tissues of tea plants are very different. It also indicates that CsARFs might be involved in regulating the growth and development of tea plants. The trend of qRT-PCR verification and analysis results were basically consistent with the transcriptome data. This study provided acertain theoretical basis and reference for further study of the CsARF gene family.

Keywords： Camellia sinensis， ARF gene family， Gene expression analysis

茶樹（Camellia sinensis L.）作為一種重要的經濟作物，在全世界多個國家及地區廣泛種植[1]。采摘茶樹鮮葉加工而成的茶葉產品具有很高的經濟價值。同時，茶葉的內含物質，如茶多酚、茶氨酸和茶多糖等，具有清腸胃、助消化、抗菌[2]、清血管、減脂[3]、降三高[4]和抗氧化[5]等保健功能，因而深受國內外廣大消費者喜愛。茶樹在生長過程中受到很多因素的影響，植物激素是其重要的調節因素之一，對茶樹的生長發育過程起到至關重要的作用。

生長素（Auxin）是植物體內最為常見的激素之一，在植物的生長分化過程中起到關鍵作用。而生長素反應因子（ARF）作為調控生長素應答基因表達的轉錄因子，對于茶樹的信號轉導及生長發育起到非常重要的作用[6]。植物對生長素信號的傳遞與轉導過程中，通常是由生長素反應因子以基因家族的形式來進行調控的，如Aux/IAA和SAUR基因家族，對于調節植物的生長發育起到了非常重要的意義[7]。ARF大多具有3個主要的結構域，即N端DNA結合結構域（DNA binding domain， DBD）、中間區域和C端二聚作用結構域（Carboxy-terminal dimerization domain， CTD）[8]。ARF特異性結合到植物生長素反應基因啟動子上的生長素反應元件（Auxin response elements，AuxRE）TGTCTC，從而控制調節生長素反應基因的特異性表達[9]。6082ADD5-E0B6-4BED-A151-861268587491

近年來，隨著基因組數據的測定，越來越多植物種類的ARF家族成員被鑒定出來，如擬南芥中ARF家族成員23個[10]、水稻中25個[11]、玉米中31個[12]、蘋果中29個[13]、梨中31個[14]、杜仲中18個[15]、蓮中30個[16]、煙草中50個[17]、番茄中17個[18]、甜橙中19個[19]等。本研究從茶樹的ARF基因家族著手展開，利用生物信息學的相關研究方法和研究軟件，對茶樹的基因組數據進行比對，找到并鑒定其ARF家族成員，并對其相關特性及通過熒光定量PCR鑒定不同組織的表達情況進行相應的研究，以期為茶樹生長發育的相關研究起到一定的參考作用。

1 ?材料與方法

1.1 ?茶樹ARF基因家族的篩選與鑒定

從茶樹數據庫（http：//tpia.teaplant.org）中下載茶樹ARF基因組相關數據，構建本地數據庫。以擬南芥與水稻已經鑒定出的ARF蛋白序列為目標序列，在茶樹蛋白庫中進行BLAST比對，設定閾值為E

將第二次所得到的茶樹ARF蛋白序列在NCBI-CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）進行保守結構域的鑒定，刪除部分不含ARF特征結構域的蛋白序列，最終得到茶樹ARF基因。在Expasy（https：//web.expasy.org/compute_pi）上鑒定茶樹ARF蛋白序列的等電點（PI）和相對分子質量。

1.2 ?系統進化樹、基因結構和蛋白質保守結構域分析

利用進化樹分析軟件MEGA7對水稻、擬南芥和茶樹的ARF蛋白進行比對，繼而采用臨近法（Boostrap=1 000）進行系統進化樹的構建。再將茶樹ARF蛋白序列提交至MEME（http：//meme-suite.org）進行保守序列分析，設置為20個模體（motif）數量，模體寬度范圍設置為6～50個氨基酸。將茶樹ARF基因的DNA序列在GSDS 2.0 （http：//gsds.cbi.pku.edu.cn）進行基因結構分析。

1.3 ?茶樹不同組織ARF的表達分析

根據已鑒定的茶樹ARF基因編號，在TPIA（http：//tpia.teaplant.org）數據庫上下載它們在茶樹不同組織（花、莖、根、頂芽、嫩葉、成熟葉、老葉）的轉錄組數據（TPM值），對數據進行標準化處理，再利用TBtools構建熱圖進行可視化。

1.4 ?茶樹ARF基因的亞細胞定位預測

利用模式識別數據庫（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/ bioinf/plant-multi）對茶樹ARF蛋白進行亞細胞定位預測[20]。

1.5 ?茶樹ARF基因順勢作用元件分析

利用茶樹基因組數據庫，截取茶樹ARF基因上游2 000 bp的基因序列，在PlantCare（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ plantcare/html）中進行順式作用元件的分析。

1.6 ? 茶樹ARF家族基因的qRT-PCR表達分析

取茶樹嫩葉、老葉和莖提取總RNA，使用改良CTAB法提取RNA，使用Genenode公司的反轉錄試劑盒進行cDNA的合成操作，以茶樹肌動蛋白基因為內參基因（Sense ： 5'-CAGACCGTATGAGCAAGGAAAT-3'，Antisense：5'-GTGCTTAGGGATGCAAGGATAG-3'），采用Primer Premier v6.0軟件設計候選基因特異性引物（表1），qRT-PCR實驗在CFX100 Realtime PCR System（Bio-Rad，CA，USA）上進行。反應條件為95 ℃30 s、95 ℃15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，40次循環，溶解溫度55～95 ℃，5 s，4 ℃保存。反應體系按照SYBR Green Realtime-PCR Mastermix說明書進行，結果通過相對定量2-ΔΔCT方法計算，最后利用Excel作圖。

2 ?結果與分析

2.1 ?茶樹CsARF基因家族鑒定及其理化性質

根據擬南芥ARF蛋白序列，在茶樹基因組蛋白序列中通過2次BLAST比對后，再通過保守結構域的篩選，去除部分不含ARF特征結構域的蛋白序列，共得到25個茶樹ARF基因。

為便于后續研究，以CsARF1-25對茶樹ARF基因進行命名。CsARF基因編碼蛋白質理化性質如表2。由表2可知茶樹CsARF蛋白中最長為1 077個氨基酸（CsARF15），最短為353個氨基酸（CsARF7），相對分子質量在39 444.98（CsARF7）至120 236.32（CsARF14）之間。較為有趣的一點是，CsARF蛋白的等電點大多小于7，可知組成CsARF蛋白的氨基酸多為酸性氨基酸。對CsARF蛋白進行亞細胞定位預測的結果可以看出，所有的CsARF蛋白都定位在細胞核內，這與其作為轉錄因子的功能相符合。

2.2 ?CsARF系統進化分析

將擬南芥ARF基因家族25個成員、水稻ARF基因家族25個成員與茶樹ARF基因家族的25個成員進行多序列比對，并利用臨近法（NJ）構建系統發育進化樹（圖1）。由圖1可得，根據擬南芥ARF基因家族的劃分，可將茶樹25個ARF分為5個亞組。其中8個CsARF基因分入Ⅰ亞組（CsARF2、CsARF6、CsARF9、CsARF14、CsARF15、CsARF17、CsARF22和CsARF25）;3個CsARF基因劃入Ⅱ亞組（CsARF11、CsARF18和CsARF16）;8個CsARF基因劃入Ⅲ亞組（CsARF4、CsARF5、CsARF8、CsARF12、CsARF19、CsARF21、CsARF23和CsARF24）;1個CsARF基因劃入Ⅳ亞組（CsARF3）;5個CsARF基因劃入Ⅴ亞組（CsARF1、CsARF7、CsARF10、CsARF13和CsARF20）。6082ADD5-E0B6-4BED-A151-861268587491

從系統進化樹中不難發現，茶樹ARF基因與擬南芥ARF基因同源性較高，而與水稻ARF基因則相對疏遠，暗示了茶樹與擬南芥ARF基因的進化時間要晚于茶樹與擬南芥的物種分化時間，而茶樹與水稻的情況則相反。

2.3 ?CsARF基因的染色體定位

利用茶樹基因組的注釋信息，可將CsARF基因定位在茶樹染色體上（圖2）。從圖2可知，CsARF在茶樹染色體上的定位并不均勻，其中7個CsARF基因不能定位在染色體上（CsARF3、CsARF5、CsARF6、CsARF7、CsARF13、CsARF22和CsARF25）。其余的18個CsARF基因不均等定位在各個茶樹染色上，其中3號、5號、9號和15號染色體上沒有CsARF基因，8號染色體上最多共有3個CsARF基因（CsARF2、CsARF17和CsARF16），其他染色體上均有1～2個CsARF基因。這種分布情況的出現有可能是源自CsARF基因在茶樹的進化過程中發生了復制或丟失。

2.4 ?CsARF基因保守結構域分析

利用NCBI-CDD和MEME分析CsARF蛋白保守結構域如圖3，可以看出同一亞組之中，保守結構域的組成和排序基本相同，其中Ⅳ亞組中沒有3號模體，而其他亞組中的第一個保守結構域均為3號模體，暗示了Ⅳ亞組的CsARF基因在進化過程中可能出現了部分丟失的情況。各個亞組之中的CsARF蛋白的保守結構域也基本一致，大部分CsARF都含有3個保守結構域（DBD、ARF和CTD），其中較為有趣的是Ⅴ亞組之中的CsARF7，作為唯一個不含ARF結構域的CsARF基因，經對比可以發現其結構域7后所連為結構域8，其間缺少了部分重要結構域，因而它不含ARF保守結構域，暗示它可能在茶樹進化過程中基因片段發生了部分丟失。

2.5 ?CsARF基因結構分析

根據茶樹基因組注釋信息，可得CsARF基因的基本結構（圖4）。從圖4中可以發現所有的CsARF都具有2個以上的外顯子;其中同一亞組之中的基因結構也基本一致，Ⅲ亞組的外顯子數目最少，只有2～3個;其他亞組的外顯子數目則相對較多，最多為17個。

2.6 ?CsARF基因順式作用元件的分析

取CsARF基因上游2 000 bp的啟動子區域序列，在PlantCare對其進行分析預測，結果如表3。所有的CsARF基因都具有光相應元件，說明CsARF基因家族與茶樹響應光照方面具有很大聯系。絕大部分CsARF基因都具有響應各種植物激素的作用，如赤霉素、乙烯、生長素和水楊酸，證明了其在調控茶樹生長發育方面起到了重要的作用。而且部分CsARF基因還具有響應茶樹生長逆境如干旱、寒冷和鹽脅迫的順式作用元件。暗示了CsARF基因可能不止與調控茶樹生長發育有關，可能在茶樹抗逆性上也起到了一定的作用。

2.7 ?CsARF基因在不同組織中的表達情況分析

為進一步了解CsARF在茶樹不同組織的表達情況，從TPIA上下載了茶樹不同組織轉錄組的TPM表達數據，對數據進行標準化處理，并對其結果構建熱圖進行分析研究，結果如圖5。CsARF3、CsARF19、CsARF23、CsARF12和CsARF24在茶樹各個組織中幾乎不表達。而CsARF2、CsARF6、CsARF7、CsARF17、CsARF13和CsARF10則在茶樹各個組織之中的表達量相對較高。CsARF15、CsARF14、CsARF9、CsARF22和CsARF1則在各組織之中有較弱表達。其中CsARF2、CsARF6和CsARF17（屬Ⅰ亞組）在莖與花中表達量最高，其他組織中的表達相對較低，而CsARF10和CsARF13（屬Ⅴ亞組）則在成熟葉、老葉、嫩葉和果實中表達量最高。這種不同的表達趨勢，可能暗示了不同亞組的CsARF基因可能參與了茶樹不同生長階段的表達。

2.8 ?RT-PCR驗證CsARF基因在茶樹不同組織的表達情況

根據CsARF的轉錄組情況，篩選出7個有顯著性差異的CsARF基因，分別為CsARF2、CsARF6、CsARF17、CsARF9、CsARF22、CsARF20和CsARF10。

對其進行不同組織的RT-PCR驗證，結果如圖6所示，CsARF基因在各組織的表達情況與茶樹轉錄組測序結果具有一定差異，但其趨勢基本保持一致。

3 ?討論

通過對茶樹全基因組的生物信息分析，共鑒定出25個CsARF基因，不同物種的ARF基因數量差距很大，如在大豆中有51個ARF基因[21]，而茶樹與水稻中則只有25個[11]。與蘋果[13]和杜仲[15]一致，絕大部分CsARF蛋白等電點（PI）都小于7，屬酸性蛋白。作為轉錄因子CsARF蛋白定位預測全部都位于細胞核，這與其他物種情況不同，如煙草的ARF定位就有部分定位于葉綠體和線粒體[17]。與擬南芥亞族的劃分一樣，可將CsARF劃分入5個亞族之中[10]，其中Ⅰ亞組和Ⅲ亞族基因數量最多，均有8個，Ⅳ亞族最少，僅有1個。通過分析結構域和保守結構域發現，大多數CsARF具有3個結構域（DBD、ARF和CTD），3號模體結構域可以與DNA結合[22]，進而與生長素反應基因啟動子上的作用元件結合，其Auxin_resp結構域通過與生長素的結合調節相關基因的表達[8]。而通過對結構域的研究不難發現，不同亞族中的模體種類和數量基本一致，不同亞族之間則差距較大，這可能是茶樹在進化過程中部分基因發生了丟失和保留。25個CsARF基因共存在7個基因對，說明茶樹在進化過程中發生了不同染色體之間的復制[23]。對基因結構的分析可以使得物種的進化關系更為明確[24]，通過對CsARF基因結構的分析，可知CsARF基因由2～17個外顯子構成，雖然不同亞族之間的外顯子個數變化較大，但其與其他物種的ARF基因外顯子數量范圍基本一致，如蘋果[13]、水稻[11]、番茄[25]等，說明ARF在物種的進化過程中相對保守。通過對CsARF基因的順式作用元件的分析發現，其對于調控茶樹生長發育和響應逆境環境也可能起到一定的作用。ARF基因對于植物的生長發育有著至關重要的作用[26]，通過對茶樹不同組織的CsARF基因的表達量研究發現，不同亞族的表達量不盡相同，有些在花和莖中表達量高（CsARF2、CsARF6和CsARF17），有些則在葉片中表達量較高（CsARF10和CsARF13）。篩選出其中表達量較高的7個基因，RT-PCR驗證結果與轉錄組測序結果基本一致。其他物種的ARF基因在不同器官的表達情況也有所區別，如擬南芥AtARF1在花中表達量最高[27]，AtARF12在果實中表達量最高[10]，AtARF19則在新葉和根中表達量最高[28]，這種不同亞族的表達量的差別原因及表達意義也是下一步的重點研究方向。6082ADD5-E0B6-4BED-A151-861268587491

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