一種MAP仿生粘合材料的合成線路優化與初步毒性評價*

成 昭 ，程詩雅，尉祎雯，馮凱茵，張雪嬌

（西安醫學院藥學院,陜西西安710021）

在人工粘合材料的合成與應用研究中,目標材料的合成可修飾性與線路設計[1-2]、材料的粘合性能與生物相容性[3-4]一直是該領域研究的兩個主要關注點。基于生物來源粘合材料,進行仿生合成設計與合成線路優化,一方面能夠保證所合成材料的生物親合性能,降低人工合成材料的細胞毒性及可能免疫應激反應,另一方面便于以合成設計思路調控材料結構、簡化合成步驟,增強人工合成材料結構的可修飾性。同時,人工合成材料來源單純,其結構與分子量均處于一定的可調控范圍,相較于生物來源材料的復雜性[5],便于設計精準實驗方案、系統考查合成材料的穩定性與毒性,建立仿生粘合材料在生命體環境中的安全性和適用性的系統評價參數。

貽貝依靠其絲足腺黏液,表現出強大的生物粘合性能[6]。貽貝分泌的生物粘合劑主要成分為貽貝粘合蛋白(mussel adhesive protein,MAP),其結構中包含高化學活性的粘合單元鄰二酚[7],通過鄰二酚在水環境中的離解與帶電[8]、氧化與交聯[9]等作用過程,實現貽貝在巖石、鋼鐵、玻璃等多種材料界面的穩定粘合[10-11]。基于仿生合成手段,設計在人工合成粘合劑中引入鄰二酚粘合單元[12],降低合成材料的細胞毒性及可能免疫應激反應,改善人工粘合劑的粘附與生物相容性能。同時,引入具有較高化學修飾性的聚氨酯片段、簡化合成步驟。通過高分子基體合成與粘合單元引入等合成步驟,得到一種新型MAP仿生粘合材料,并進行合成路線設計、材料熱穩定性與細胞毒性考查,初步評價了該仿生粘合材料進一步應用于生命體環境的安全性和適用性[13]。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

儀器：TENSOR T-27傅里葉變換紅外分光光度計(德國BRUKER)；AVANCE Ⅲ超導核磁共振波譜儀(德國BRUKER,400MHz,溶劑DMSO-d6,內標TMS)；PLGPC50凝膠滲透色譜儀(美國Agilent Technologie)；PE-TGA7熱失重分析儀(美國Perkin Elmer)；1510 Mwltiskan Go多功能酶聯免疫檢測儀(美國Thermo Fisher)。

試劑：異佛爾酮二異氰酸酯(IPDI)、聚丙二醇1000(PPG 1000)、二羥甲基丙酸(DMPA)、二丁基二月桂酸錫(DBTL)、N,N'-二環己基碳二亞胺(DCC)、多巴胺鹽酸鹽、三乙胺等試劑,DMF、DMSO等反應溶劑,均為分析純,購自阿拉丁試劑有限公司。

1.2 合成

通過擴鏈、偶聯兩步主要反應,合成得到一種新型MAP仿生粘合材料（圖1）。

如合成路線圖1所示,擴鏈過程首先經由1）IPDI氰鍵與PPG 1000羥基作用得到聚氨酯預聚物（化合物1）,再經2）化合物1與擴鏈劑DMPA、縮合劑DCC、催化劑DBTL共同作用,得到聚氨酯預聚物的擴鏈產物（化合物2）；在擴鏈產物（化合物2）的結構基礎上,為了接入鄰二酚粘合單元、實現材料功能修飾,同時,進一步調控目標粘合材料的分子量,經由3）偶聯過程進行目標粘合材料的側鏈修飾,得到了一種MAP高分子仿生粘合材料（化合物3）。

圖1 MAP仿生粘合材料的合成路徑Fig. 1 Synthetic route of the biomimetic MAP adhesive material

基于MAP中鄰二酚結構離解吸附與氧化交聯共同作用的粘合機制,進行仿生合成設計,能夠初步保證目標粘合材料（化合物3）的低毒性及生物相容性；同時,進行擴鏈、偶聯的分步合成,實現了對合成路線的分段調控,加強了粘合材料合成的可修飾性,為人工粘合材料未來研發工作中的分節點合成與功能化修飾提供了參考。

1.2.1 聚氨酯預聚物（化合物1）的合成[14]

DMF為溶劑、氮氣保護下,將物質的量之比為2：1.2的IPDI與PPG 1000混合均勻,反應6h后,減壓蒸餾,得到無色至淺黃色的油狀物,即為聚氨酯預聚物（化合物1）。

1.2.2 聚氨酯預聚物擴鏈產物（化合物2）的合成

DMF為溶劑、氮氣保護下,將物質的量之比為1：2：0.2的聚氨酯預聚物（化合物1）、DMPA、DBTL混合均勻,反應3h,得到無色至淺黃色油狀物,即為聚氨酯預聚物擴鏈產物（化合物2）。

1.2.3 目標MAP粘合材料（化合物3）的合成

DMF為溶劑、氮氣保護下,將物質的量之比為1：0.12：1:0.1：15的聚氨酯預聚物擴鏈產物（化合物2）、DCC、多巴胺鹽酸鹽、三乙胺、DMF混合均勻,反應8h后,得到粗產物沉淀。進行粗產物的酸洗、透析,得到目標MAP粘合材料（化合物3）,為淺黃色油狀物。

2 結果與討論

2.1 結構表征

2.1.1 IR與枝節率

以KBr壓片法對所合成的MAP粘合材料進行IR測定,得到圖2。無論合成條件如何改變（如圖2中淺灰、灰、黑色所標注的投料比變化以及催化劑DBTL加入與否）,3400～3500 cm-1處酚羥基與1600～1700 cm-1處酰胺鍵的特征吸收峰均有出現,只是呈現百分透過率,即吸收峰強度的差別。

圖2 MAP粘合材料的紅光吸收光譜Fig. 2 IR spectra of the MAP adhesive material

對比圖2中所標注的淺灰、灰、黑色3個系列的吸收譜線,可知：1）在化合物2的合成中,控制催化劑DBTL加入量及其他反應條件不變,僅調控化合物1與DMPA的投料比,即初始反應物PPG 1000（與化合物1物質的量近似相當）與DMPA的投料比分別為PPG 1000：DMPA=1：1與1：3時,得到相應為灰色（PPG 1000：DMPA=1：1）與黑色（PPG 1000：DMAP=1：3）標注的2個系列吸收譜線,其中,各官能團特征吸收峰的百分透過率呈現明顯差異；2）進一步對比催化劑未加入的淺灰色系列與催化劑加入的灰色/黑色系列,也呈現類似的官能團吸收峰強度差別。綜合1）與2）兩方面差別,能夠對目標MAP粘合材料側鏈中、鄰二酚粘合單元的接入量做出初步判斷,同時,能夠對催化劑DBTL影響聚氨酯預聚物進行擴鏈反應時的枝節率做出分析,還可進一步實現對枝節率與MAP材料粘合性能相關性的分析。人工粘合材料的未來研發,將可圍繞著催化劑品類與性能的改變、催化劑加入量的調控等方向進行,實現對粘合性、枝節率等性能參數的進一步調控。

2.1.21H NMR

DMSO-d6做溶劑、TMS為內標,對所合成的MAP粘合材料進行1H NMR測定,得到其核磁共振氫譜,特征氫的化學位移如圖3所示標注。其中,δ=8.28與～3.70分別對應于羧基與酚羥基中活潑氫的特征位移,說明MAP粘合材料的側鏈結構中,已通過聚氨酯預聚物擴鏈產物（化合物2）與多巴胺鹽酸鹽的擴鏈反應,成功接入了鄰二酚粘合功能單元。

圖3 催化劑DBTL加入與未加入時MAP粘合材料的核磁共振氫譜Fig. 3 1H NMR spectra of the MAP adhesive material with and without DBTL catalyst

此外,對圖3中(PPG 1000-IPDI): DMPA 分別為1：1與1：3的2個系列譜線對比可知,保持測樣量一致時,增加擴鏈劑DMPA在擴鏈反應中的用量,得到 (PPG 1000-IPDI)：DMPA=1：3系列的譜線強度顯著增強,再結合圖2中的官能團特征吸收峰強度隨投料比的相應變化,能夠對擴鏈反應中影響粘合材料枝節率的兩種影響因素做出進一步判斷,即催化劑DBTL與擴鏈劑DMPA均能顯著提高目標MAP粘合材料的枝節率,從而進一步影響其粘合性能。

2.1.3 GPC與分子量分布

以聚苯乙烯為標準聚合物,流動相為含0.01 mol/L溴化鋰的DMF(流速1.0 mL/min),40°C下、進行所合成MAP粘合材料的GPC測定,得到表示聚合物分子量及其分布的圖4及表1。其中,由表1中接近于1的多分散指數PD=Mw/Mn可知,所合成的MAP高分子粘合材料聚合分布均勻,其黏均摩爾質量Mv=1193。

圖4 MAP粘合材料的凝膠滲透色譜Fig. 4 Gel permeation chromatography of the MAP adhesive material

表1 MAP粘合材料的分子量及分布Table 1 Molecular weight and distribution of the MAP adhesive material

2.2 粘合材料穩定性與安全性評價

2.2.1 熱穩定性

氮氣條件下,進行所合成MAP粘合材料的熱失重分析(樣品用量5mg,升溫速率20°C/min,溫度范圍40～600 °C),得到圖5。

圖5 MAP粘合材料的熱重分析曲線Fig. 5 Thermogravimetry curve of the MAP adhesive material

由圖5可見,所合成材料的熱失重曲線平滑、連續,具有良好的穩定性,表現出與彈性體熱穩定趨勢的一些相似性[15-16]。兩個熱失重段分別處于1）150～250 °C與2）250～350 °C,分別對應于聚氨酯材料結構中1）因IPDI和DMPA分解而產生的軟段熱失重,以及2）由于PPG 1000分解所形成的硬段熱失重。

2.2.2 細胞毒性

將對數生長期的EVC304細胞接種于96孔板,于37°C、5%CO2及90%濕度條件下培養24h,待細胞貼壁后更換新培養基,再加入所合成粘合材料的DMF溶液,進行目標材料的濃度梯度分組,每組濃度設6個平行孔,使各組中的粘合材料終質量濃度分別為125、250、500、1000、2000、4000 μg/L,對照組則加入等體積溶劑。于37°C恒溫培養箱中,將上述加樣后的96孔板培養24h,去除培養基,每孔加入配置好的20μL MTT溶液和180μL培養液,繼續培養4h。移去上清液后,每孔加入150μL二甲基亞砜,震蕩10min(頻率60次/min),測定490nm處的吸光度數值[17-18],計算細胞增殖抑制率：細胞增殖抑制率(%)=(1-吸光度實驗組/吸光度對照組)× 100%,繪制得到所合成MAP粘合材料對體外ECV304細胞的增殖抑制曲線（圖6）。結果顯示,所合成MAP粘合材料在ECV304細胞中的增殖抑制作用隨自身濃度增加而增大,就其濃度增幅的整體趨勢而言,該合成材料呈現低毒性[19]。

圖6 MAP粘合材料對ECV304細胞的24h增殖抑制作用Fig. 6 Cytotoxicity of the MAP adhesive material on ECV304 at 24h

3 結論

基于MAP鄰二酚結構離解吸附與氧化交聯共同作用的粘合機理,經由仿生合成路徑得到一種MAP型粘合材料,以熱失重分析、MTT實驗初步評價所合成粘合材料的熱穩定性與生物安全性,同時,通過IR、1H NMR、GPC等表征該粘合材料結構。綜合實驗結果,合成得到的MAP型粘合材料表現良好的熱穩定性與低毒性,具有進一步應用于生物醫學領域、進行快速粘合修復的良好前景。

該粘合材料經由擴鏈、偶聯的分步合成方法,實現了對合成路線的分段調控,加強了粘合材料合成的可修飾性,為人工粘合材料未來研發工作中的分節點合成與功能化修飾提供了參考。