超高濃度乙醇連續發酵體系振蕩行為誘發因素研究

譚慧萍， 王惠國， 王林會， 趙增彤， 程楊好， 劉晨光， 王 亮*， 李 倩*

1.大連大學生命科學與技術學院，遼寧大連 116622；

2.大連賽姆生物工程技術有限公司，遼寧大連 116620；

3.大連工業大學生物工程學院，遼寧大連 116034；

4.微生物代謝國家重點實驗室上海交通大學生命科學與技術學院，上海 200240

上世紀末，學術界相繼提出了高濃度（High gravity，HG）和超高濃度（Very high gravity，VHG）發酵的概念，并成功將其應用到乙醇發酵中，使發酵終點乙醇濃度從6%～8%（v／v）提高到10%～21%（v／v）［1，2］。VHG乙醇發酵技術不僅能夠降低下游精餾分離和廢水處理成本，而且不需要增加額外的設備投入，是降低燃料乙醇生產成本的有效方案［3，4］：（1）燃料乙醇生產成本中，能耗成本居第二，僅次于原料成本；（2）市場上存在多種廉價高效的酶制劑，如α-淀粉酶、糖化酶和蛋白酶等，這使得超高濃度底物易獲得。

周期性的振蕩行為在微生物細胞連續培養和發酵過程中時常發生，如Saccharomyces cerevisiae［5，6］、Zymomonas mobilis［7］、Escherichia coli［8］和Clostridium butyricum［9］等培養過程都曾觀察到這一現象。對于釀酒酵母S．cerevisiae低糖連續培養過程中的振蕩行為已經研究得較為透徹，主要分為糖酵解振蕩和代謝振蕩行為，其振蕩參數包括葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、ATP、NADPH等胞內代謝物濃度，以及溶氧濃度（DO）、耗氧速率、二氧化碳釋放率等發酵參數，振蕩周期在幾分鐘到幾小時之間。然而，BAI等在釀酒酵母VHG乙醇連續發酵體系中報道了另一種振蕩行為（VHG振蕩）［3，10-11］，明顯不同于糖酵解振蕩和代謝振蕩，這種振蕩行為的振幅更大（可達50%）、周期更長（5 d～7 d），振蕩的特征參數包括殘糖、乙醇和生物量濃度等。隨后，BAI等在研究稀釋速率（0.015 h-1～0.08 h-1）對VHG乙醇連續發酵影響時，發現改變稀釋速率可以獲得振蕩和穩態兩種不同發酵狀態［12］，并提出VHG振蕩行為的產生與操作條件和系統的初始狀態有關。

雖然后續研究顯示，木塊固定化細胞［10，13］和發酵偶聯氣提實時移除部分乙醇［14，15］可以有效弱化VHG振蕩行為，然而，除稀釋速率外，缺乏對VHG振蕩行為直接誘發因素的研究。本研究基于前期研究基礎，研究菌種、培養基成分、氧供應等對VHG振蕩行為的影響，進一步探究了比生長速率、比死亡速率、稀釋速率和細胞乙醇耐受性對釀酒酵母VHG乙醇連續發酵的調控作用。

1 實驗材料和方法

1.1 菌種

實驗室釀酒酵母S．cerevisiae S288c和工業釀酒酵母S．cerevisiae 4126均由本實驗室保藏；自絮凝酵母S．cerevisiae BHL01，由工業釀酒酵母S．cerevisiae 4126經染色體整合絮凝基因FLOI得到［16］，由本實驗室保藏。

1.2 培養基

搖瓶種子培養基（g／L）：葡萄糖30，酵母粉5，蛋白胨3，121℃滅菌15 min。

發酵罐種子培養基（g／L）：葡萄糖120，酵母粉5，蛋白胨3，121℃滅菌15 min。

YPD發酵培養基（g／L）：葡萄糖280，酵母粉5，蛋白胨3。為減少在高溫滅菌過程中的糖損失，發酵培養基滅菌條件為110℃，15 min，滅菌完成后立即用自來水冷卻至室溫。

合成培養基：氮磷鎂成分（g／L）（NH4）2SO45，KH2PO43，MgSO4·7 H2O 0.5，121℃滅菌15 min。微量鹽成分（mg／L）EDTA 15，ZnSO4·7 H2O 4.5，CoCl2·6 H2O 0.3，MnCl2·4H2O 1，CuSO4·7 H2O 0.3，CaCl2·2 H2O 4.5，FeSO4·7 H2O 3，NaMoO4·2 H2O 0.4，H3BO31，KI 0.1，121℃滅菌15 min。維生素成分（mg／L）生物素0.05，泛酸鈣1.0，煙酸1.0，肌醇25.0，維生素B11.0，維生素B61.0，對氨基苯甲酸0.2，0.45μm膜濾除菌。厭氧發酵過程培養基中添加15μL麥角固醇和660μg／L Tween-80，為酵母細胞膜合成提供前體，115℃滅菌15 min。各組分配制成高濃度母液，并單獨進行滅菌，4℃避光保存，使用前配制成所需終濃度，添加到葡萄糖溶液中。

1.3 種子培養及乙醇連續發酵

搖瓶種子培養：從4℃冰箱中取菌種保存試管，接種到170 mL種子培養基中進行活化，在30℃，150 r／min條件下培養20 h。將活化后種子轉接到新鮮的種子培養基中，30℃，150 r／min培養18 h。

發酵罐批次種子培養：搖瓶種子以10%（v／v）的接種量接入裝液量為1.7 L的攪拌式發酵罐（KBT-2.5 L，韓國）中進行培養，通過流加2 mol／L NaOH控制pH在（4.50±0.02），通氣速率、溫度、攪拌速率分別設定為0.05 vvm、30℃、300 r／min。

連續乙醇發酵：連續攪拌反應裝置如圖1所示，當培養基中的殘糖濃度低于1 g／L，分批種子培養結束，開啟蠕動泵3以0.027 h-1的稀釋速率向發酵罐4中流加發酵培養基，同時打開發酵罐的溢流口，通過溢流口控制有效發酵體積為1.7 L，溫度、pH、通氣、攪拌速率等操作條件與發酵罐種子培養時相同。

圖1 乙醇連續發酵系統示意圖

1.4 分析方法

1.4.1 生物量測定

選用細胞干重法進行測定［3］。

1.4.2 葡萄糖、乙醇和甘油的測定

選用Waters高效液相色譜測定，選用色譜柱（Aminex HPX287H，300 mm×7.8 mm）；檢測器選用Waters410示差檢測器；流動相用5 mmol／L的H2SO4；流速設為0.5 mL／min，柱溫設為50℃。

1.4.3 酵母乙醇耐受性實驗［17］

將斜面菌種進行搖瓶活化后，用生理鹽水（0.9%NaCl，w／v）配制成相同OD600的菌懸液，分別用12%和16%（v／v）的乙醇溶液沖擊2 h，涂平板，30℃培養24 h后，計細胞菌落數，與0 h的對照菌落數對比計算存活率。

2 實驗結果與討論

2.1 菌株差異對VHG乙醇連續發酵的影響

2.1.1 酵母菌株的乙醇耐性比較

本實驗選取三株釀酒酵母S．cerevisiae 4126、S．cerevisiae S288c和S．cerevisiae BHL01，分別進行了乙醇沖擊實驗，比較其乙醇耐受性，結果如圖2所示。經12%（v／v）乙醇沖擊2 h后，酵母細胞S．cerevisiae 4126和S．cerevisiae BHL01的存活率分別為81.5%和88.1%，而S．cerevisiae S288c只有66.1%；經16%（v／v）乙醇沖擊2 h后，只有S．cerevisiae BHL01的存活率能夠維持在43.3%，而S．cerevisiae 4126和S．cerevisiae S288c的存活率則分別降至27.2%和16.3%。可見，這三株酵母菌株的乙醇耐性由高到低依次為S．cerevisiae BHL01、S．cerevisiae 4126及S．cerevisiae S288c。

圖2 酵母菌株的乙醇耐受性比較

2.1.2 不同乙醇耐性菌株的VHG乙醇連續發酵

S．cerevisiae 4126、S．cerevisiae S288c和S．cerevisiae BHL01三株乙醇耐性不同的酵母菌的VHG乙醇連續發酵參數（殘糖、乙醇、甘油和生物量濃度等）如圖3所示，發現S．cerevisiae 4126及S．cerevisiae BHL01連續發酵體系中發酵參數均呈現周期性振蕩行為（圖3a、3b），而類似振蕩行為未在S．cerevisiae S288c連續發酵體系中觀察到，隨發酵時間延長S．cerevisiae S288c體系逐漸發展成高底物濃度（136.4 g／L～149.8 g／L）、低產物濃度（46.5 g／L～56.8 g／L）的擬穩態狀態（圖3c），表明VHG振蕩行為的產生與菌種有關。

圖3 三株不同乙醇耐受性酵母菌的VHG乙醇連續發酵

如表1所示，S．cerevisiae BHL01、S．cerevisiae 4126和S．cerevisiae S288c VHG連續發酵體系的最大乙醇濃度分別為88.4 g／L、71.3 g／L和56.8 g／L，可見S．cerevisiae BHL01和S．cerevisiae 4126的乙醇生產能力要強于S．cerevisiae S288c，這與其乙醇耐受性數據一致。另外，三株酵母菌的VHG體系中乙醇濃度變化幅度也是S．cerevisiae BHL01最大（31.6 g／L）、S．cerevisiae 4126其次（20.0 g／L）、S．cerevisiae S288c最?。?.2 g／L），同樣其乙醇生成速率也具有這樣的大小關系。高乙醇生成速率會造成胞內乙醇積累，胞內的高濃度乙醇會嚴重損傷和破壞細胞器和酶，導致細胞活力下降甚至死亡［18］。以發酵參數的振幅而言，S．cerevisiae BHL01發酵體系的參數波動要明顯強于S．cerevisiae 4126體系，而S．cerevisiae 4126體系要強于S．cerevisiae S288c體系，這種強弱關系與三株酵母菌的乙醇耐受性強弱一致，表明VHG振蕩的強弱可能與酵母細胞的乙醇耐受性有關。

表1 三株酵母菌的VHG乙醇連續發酵參數

S．cerevisiae BHL01、S．cerevisiae 4126和S．cerevisiae S288c VHG發酵體系的參數變化顯示，S．cerevisiae BHL01和S．cerevisiae 4126體系的乙醇濃度都超過了其最大乙醇耐受濃度，發酵體系中的高濃度乙醇對細胞的生長和代謝產生了抑制作用；而S．cerevisiae S288c的乙醇發酵生產能力弱，在VHG連續發酵過程中，當乙醇濃度達到46.5 g／L～56.8 g／L時（低于其最大乙醇耐受濃度），同時細胞的乙醇生產能力達到極限，發酵液中乙醇濃度不會繼續增加，不會對酵母細胞的生長代謝和乙醇合成代謝產生明顯抑制作用，乙醇生成速率維持在恒定水平。此時，細胞乙醇生成與細胞乙醇耐性之間達到了一定平衡，最終發酵體系達到了含有約150 g／L的殘糖濃度的擬穩態。S．cerevisiae BHL01、S．cerevisiae 4126和S．cerevisiae S288c VHG發酵體系的參數變化表明，酵母細胞的乙醇耐受性對VHG振蕩行為具有重要影響，在同一發酵體系中菌株乙醇耐受能力越強，其誘發的振蕩行為越劇烈。

2.2 乙醇脅迫對S．cerevisiae 4126 VHG乙醇連續發酵的影響

基于上述研究結果，本實驗以低糖穩態體系［15］為對照體系，向其中流加含50 g／L或70 g／L乙醇的低糖發酵培養基，考察外源乙醇脅迫對VHG連續發酵過程的影響（見圖4）。這里的對照體系指以S．cerevisiae 4126為實驗菌株、流加含有低濃度葡萄糖（120 g／L）的培養基進行乙醇連續發酵可達到穩態系統。

圖4 外源乙醇添加對酵母細胞低糖乙醇連續發酵體系的影響

圖4顯示，外源流加50 g／L乙醇能夠誘發低糖穩態體系產生周期性振蕩行為，殘糖、乙醇和生物量（DCW）濃度分別在（39.0～99.1）g／L、（49.5～84.4）g／L和（0.4～3.8）g／L范圍振蕩，平均濃度分別為67.7 g／L、66.7 g／L和1.9 g／L，振蕩周期約為105 h。此外，添加30 g／L或40 g／L乙醇時，均能夠誘導周期性振蕩行為，且高濃度外源乙醇能夠誘導更長周期、更大振幅的振蕩行為［15］。然而，當添加更高濃度乙醇（70 g／L）時，發酵參數變化卻并不顯著，殘糖、乙醇和生物量濃度分別在106.0 g／L～114.1 g／L、62.8 g／L～73.8 g／L和0.03 g／L～0.6 g／L范圍波動。生物量平均濃度不到0.5 g／L，表明此時細胞生長幾乎被完全抑制，而且流加培養基中底物葡萄糖僅消耗10 g／L左右，揮發損失使得發酵液中乙醇濃度（62.8 g／L）甚至低于流加培養基中初始濃度（70 g／L），表明外源70 g／L乙醇施加的抑制程度超過了連續發酵體系中酵母細胞的乙醇耐受性。

研究結果表明，在酵母細胞可耐受范圍內，通過向低糖穩態系統中外源添加乙醇，對細胞施加抑制，可誘發穩態系統的發酵參數出現周期性振蕩行為，且施加的乙醇抑制越強，誘發的振蕩行為振幅越大、周期越長，而當外源添加乙醇解除時，發酵體系會逐漸恢復到穩態狀態。

2.3 培養基組成和氧供應對釀酒酵母振蕩行為的影響

前期研究表明，乙醇連續發酵體系振蕩行為是一種復雜生物行為，是胞外以及胞內因素共同作用的結果［15］，基于S．cerevisiae 4126 VHG連續振蕩體系，本實驗選取了對細胞生長狀態有影響的培養基組成和通氣供應來考察振蕩行為受到的影響。

如圖5所示VHG乙醇連續發酵，使用營養豐富的YPD培養基時，發酵參數呈現大幅度、周期性振蕩行為。然而，將流加培養基切換成合成培養基后，雖然200 h內也觀察到了較為明顯的參數振蕩行為，但運行約300 h后發酵參數的振蕩幅度逐漸變小，最后趨于穩定，維持在高殘糖（～160 g／L）、低乙醇（～50 g／L）濃度水平，這種振蕩行為類似阻尼振蕩。

圖5 培養基組成對酵母細胞VHG振蕩行為的影響

YPD培養基能夠給酵母細胞提供足夠養分，維持細胞合成以及分解代謝，在無乙醇抑制條件下，能夠使細胞獲得高比生長速率和高乙醇比生成速率。然而，合成培養基中營養匱乏，無法提供滿足酵母細胞生物量積累及乙醇發酵的充足營養，限制了細胞生長和乙醇生成速率，隨著連續發酵的進行，發酵液中的乙醇濃度和細胞濃度不斷被稀釋，最后維持在一個低乙醇濃度的環境下，避免了發酵體系中出現高濃度乙醇以及乙醇濃度動態變化產生的抑制作用。

圖6所示，停止通氣對發酵體系參數振蕩行為影響顯著，通氣停止后酵母細胞生物量積累以及乙醇生成受到了明顯抑制，濃度逐漸減少，同時發酵液中殘糖濃度不斷升高，振蕩行為逐漸消失。供氧對細胞生長非常重要，氧分子參與細胞中氧化磷酸化過程產生大量ATP，為細胞代謝活動提供能量，而在厭氧條件下1分子葡萄糖通過糖酵解途徑僅能產生2分子的ATP，能量供應相對不足。雖然VHG乙醇連續發酵過程中通氣速率較小，僅0.05 vvm，但溶解氧被細胞利用后使糖酵解產物丙酮酸進入TCA循環得到進一步氧化，為酵母細胞代謝提供足夠ATP。因此，供氧或能量供應有助于酵母細胞VHG連續振蕩行為的維持，表明這是一個耗能過程。

圖6 供氧對酵母細胞振蕩行為的影響

2.4 VHG振蕩行為分析

VHG乙醇連續發酵過程中，酵母細胞遭受高濃度底物的滲透壓脅迫以及高濃度產物乙醇的抑制作用，周期性振蕩行為的產生是環境和細胞因素綜合作用的結果［15，19，20］。前期研究表明，高濃度底物的滲透壓脅迫以及細胞周期變化與VHG振蕩行為無直接關聯［15，19］，通過木塊固定化提高酵母細胞乙醇耐受能力［10，13］和發酵偶聯氣提操作實時移除發酵液中部分乙醇［14，15］都能夠有效弱化VHG振蕩行為，且通過改變VHG乙醇連續發酵的稀釋速率可以切換穩態和振蕩狀態［12］。本研究結果表明，細胞乙醇耐受性差異（與菌種、外源乙醇脅迫等有關）和細胞生長和能量狀態（與培養基組成、供氧等有關）對VHG振蕩行為有顯著影響。

每株酵母菌都存在一個臨界乙醇耐受濃度Ecrit，當發酵體系中乙醇濃度E超過Ecrit時，會對細胞生長和代謝產生抑制作用。在底物葡萄糖過量（280 g／L）和營養充足（YPD培養基）的VHG乙醇連續發酵體系中（無限制性基質存在），細胞濃度變化率和乙醇濃度變化率滿足：及稀釋速率。

當發酵體系中乙醇濃度E低于Ecrit時，產物乙醇對細胞生長和代謝的影響可忽略（無限制性產物存在），此時細胞比生長速率達到最大μmax，遠大于稀釋速率D（此時細胞比死亡速率α可忽略不計），發酵體系中細胞不斷積累。厭氧或微氧條件下，釀酒酵母的乙醇積累與細胞生長相關，發酵體系中乙醇濃度隨細胞生長而不斷積累。當發酵液中乙醇濃度E超過臨界乙醇耐受濃度Ecrit時，高濃度乙醇會抑制細胞生長使其比生長速率μ逐漸減小，此時比死亡速率α不斷增加。在細胞比生長速率μ逐漸減小的過程中，細胞生長速率d X／d t和乙醇生成速率d E／d t隨之發生著變化，從式（1）和（2）可知d X／d t和d E／d t的變化趨勢并不一致，這與VHG振蕩周期中觀察到生物量濃度和乙醇濃度曲線的相位差吻合［3，15，19］，文獻顯示生物量濃度較乙醇濃度先出現下降，在S．cerevisiae 4126 VHG連續振蕩體系中這種相位差約24 h，這種差異正是由于細胞生長和乙醇生成對乙醇脅迫的響應不同造成的，這可能是誘導周期性VHG振蕩行為的關鍵。基于此，VHG振蕩行為的調控與μ，D和α相關，而α與細胞乙醇耐受性（Ethanol tolerance，Et）密切相關，本研究提出VHG振蕩調控與μ，D和Et存在一定函數關系。除稀釋速率D外［12，21］，本研究結果證實比生長速率μ（與培養基組成、供氧狀態等相關）以及乙醇耐受性Et（菌種差異、外源乙醇脅迫等相關）是VHG振蕩行為產生的另外兩個關鍵因素。

3 結 論

其中，X、S0、S、E、μ、qeth、α及D分別表示細胞濃度、流加培養基中初始糖濃度、殘糖濃度、乙醇濃度、細胞比生長速率、乙醇比生成速率、細胞比死亡速率

（1）VHG振蕩行為的產生與酵母細胞的乙醇耐受性有關，且乙醇耐受性越強的酵母菌的振蕩行為越顯著；在酵母細胞可耐受范圍內，向低糖穩態系統中施加外源乙醇脅迫，可誘發周期性振蕩行為，且施加的乙醇抑制作用越強，誘發的振蕩行為越劇烈，而當外源乙醇脅迫解除時，發酵體系可恢復到穩態狀態。

（2）VHG振蕩行為的產生與培養基組成以及氧供應相關，營養和能量供應是維持周期性VHG振蕩的重要因素。

（3）VHG振蕩行為的產生與比生長速率μ、比死亡速率α、稀釋速率D以及乙醇耐受性Et相關，且細胞生長和乙醇生成對乙醇脅迫的響應不同可能是誘發VHG振蕩行為的關鍵。