Alteromonas macleodii木聚糖酶XynZT-3序列分析及表達研究

石嘉寧， 徐 佳， 孔夢圓， 王寧寧， 田艷杰， 崔彩霞， 周晨妍

新鄉醫學院生命科學技術學院河南省合成生物學工程實驗室，河南新鄉 453003

在自然界的可再生資源中，木聚糖的含量僅次于纖維素［1-2］。作為半纖維素主要組成成分的木聚糖，由于其結構復雜，在自然條件下很難降解，它的降解需要多種酶的共同參與。木聚糖酶主要存在于植物、動物和微生物中，木聚糖酶通過隨機的方式作用于木聚糖主鏈，將其降解為木糖和低聚木糖［3-6］。木聚糖酶在許多行業都有廣泛的應用，包括食品工業［7-9］、動物飼料生產［10］和紙漿生物漂白［11-12］等。

CAZy數據庫（http：／／www.cazy.org）分析顯示，在糖苷水解酶（GH）第62、51、43、11、10、9、5等家族均有歸類的木聚糖酶［13-14］。不同家族木聚糖酶在結構、酶學性質及適用領域上均存在較大差異［15］，其中GH10家族由一個催化結構域和一個纖維素結合結構域組成，該結構域由pI在8.0～9.5之間的連接肽連接，在結構上呈“桶狀”結構。

麥氏交替單胞菌（Alteromonas macleodii）是本實驗室在煙臺近海分離出的一株海洋微生物，課題組從麥氏交替單胞菌基因組中分析到木聚糖酶XynZT-3基因的存在，已將該基因序列在Genbank登錄，登錄編號為MT 814 837。本研究對木聚糖酶XynZT-3基因進行生物信息學分析及相應的表達條件優化，以期為該酶的進一步研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Alteromonas macleodii（麥氏交替單胞菌）HY35由實驗室保存，克隆宿主Escherichia coli（大腸桿菌）DH5α購自Novagen公司，Pichia pastoris（畢赤酵母）GS115及pPIC9K表達質粒購買于Invitrogen公司。

T4DNA連接酶、限制性內切酶、E×Taq DNA聚合酶、DNA Marker、異丙基-β-D-硫代半乳糖糖苷（IPTG）：TaKaRa生物技術有限公司；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒及DNA小量抽提試劑盒、卡那霉素：上海生工生物工程有限公司；根據Invitrogen公司畢赤酵母操作手冊配制酵母培養基BMMY、BMGY、YPD、MD。

Tprofessional 96 PCR分析儀：德國Biometra公司；穩壓穩流電泳儀（DYY-2）：北京市六一儀器廠；電轉化儀（GenePulserII）：美國BIO-RAD公司；紫外可見分光光度計UV759：上海佑科儀器儀表有限公司低溫恒溫槽（DC-0506）：上海比朗儀器有限公司。

1.2 序列分析

查閱網站（https：／／npsa-prabi.ibcp.fr／cgi-bin／npsa_automat.pl？page＝／NPSA／npsa_sopma.html）對酶蛋白二級結構進行預測。利用網站（https：／／swissmodel.expasy.org／）對酶蛋白三維結構進行預測。通過網站（http：／／pfam.xfam.org／search／＃tabview＝tab1）預測基因結構域。采用軟件DNAMAN 9.0繪制進化樹、分析同源序列。通過網站（https：／／web.expasy.org／protparam／）理論等電點常數（pI）和計算分子量（MW），利用NetNGlyc1.0（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／NetNGlyc／）對潛在的糖基化位點進行預測。

1.3 密碼子優化及目的基因合成

不同物種對密碼子的使用頻率不同，為了將目的基因后期能在畢赤酵母中較好表達，通過網站（http：／／www.jcat.de／）對木聚糖酶基因序列進行密碼子優化，原始序列中GC含量為45.8%，優化后GC含量為48.7%，交由蘇州金唯智生物科技有限公司進行目的基因的合成。

1.4 引物設計

根據A．macleodii木聚糖酶基因序列xynZT-3，以及P．pastoris表達載體pPIC9K的多克隆位點，設計出兩條引物。

1.5 重組載體的構建

以合成的目的基因為模板進行PCR擴增，擴增結束后，制備1%瓊脂糖凝膠觀察擴增情況，目的條帶割膠回收、雙酶切和連接［16］。連接液轉化感受態E．coli DH5α，對長出的克隆子，提取質粒送至上海生工生物工程有限公司進行測序驗證。

1.6 重組菌的構建

大量提取表達載體質粒DNA，SalⅠ線性化酶切后，通過1%瓊脂糖凝膠電泳觀察擴增情況，并割膠回收。將重組質粒電擊轉化到GS115感受態中，在含有不同濃度G418的YPD平板上進行重組菌的篩選。

1.7 重組菌搖瓶培養及誘導表達

挑選含有G418（終濃度為1.25 mg／mL）的YPD平板上菌落較大的克隆子［17］，分別接種到30 mL BMGY培養基中，以含有GS115空載體的重組菌做對照，30℃，220 r／mim搖床培養，當細胞濃度達到A600＝0.6左右時，離心收集沉淀；加入30 mL BMMY培養基發酵，30℃，220 r／mim搖床培養，每隔24 h加入150μL甲醇誘導，培養3～7 d，發酵液離心后取上清，測木聚糖酶活力。

1.8 木聚糖酶活力測定

采用DNS法［18］測定木聚糖酶活力。酶活力單位的定義：在pH 7.0、45℃的反應條件下以0.5%樺木木聚糖為底物，反應15 min，以每分鐘產生1 μmoL木糖所需的酶量為一個酶活力單位。

1.9 木聚糖酶蛋白電泳分析

將2×SDS蛋白上樣緩沖液加入到處理好的酶液中，混勻后，將其變性（煮沸10 min），離心（10 000 r／mim）10 min，SDS-PAGE電泳檢測上清，染色1 h（考馬斯亮藍R-250），脫色后，觀察目的條帶。

1.10 發酵條件優化

選擇誘導溫度（12℃、16℃、20℃、24℃和28℃）、甲醇誘導劑的濃度（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%）、種齡（16 h、20 h、24 h、28 h和32 h）、誘導時間（3 d、4 d、5 d、6 d和7 d）和誘導pH（pH 3、pH 4、pH 5、pH 6、pH 7、pH 8和pH 9）這幾個因素，設計單因素實驗［19-20］，在單因素實驗的基礎上，對重組菌產酶能力采用四因素三水平N＝29的Box-Behnken［21-22］響應面實驗設計和研究，以誘導溫度、甲醇濃度、種齡和pH為響應面自變量設計因素水平表（表1）。

表1 響應面因素水平表

2 結果與分析

2.1 木聚糖酶序列分析

麥氏交替單胞菌HY35基因組中的木聚糖酶XynZT-3基因序列在Genbank登錄，登錄編號為MT 814 837。xynZT-3序列全長為2970 bp，該序列成熟肽編碼989個氨基酸（圖1），沒有內含子和信號肽區域，下劃線標注的第29至第313氨基酸序列為編碼的GH10家族結構域。xynZT-3預測等電點（pI）為4.15，分子量為107.74 kDa，分子式為C4827H7340 N1246O1535S11，預測存在7個潛在的N糖基化位點（N5AT，N97ET，N158IT，N563GS，N772YT，N878GS，N968GS）。

圖1 木聚糖酶XynZT-3序列分析

2.2 木聚糖酶氨基酸序列比對分析

從NCBI中挑選出不同糖苷水解酶家族的木聚糖酶基因序列，利用DNAMAN9.0軟件對XynZT-3進行系統進化樹比對，由圖2可以看出，XynZT-3與GH10家族的木聚糖酶序列屬于一個分支，由此可進一步推斷XynZT-3屬于糖苷水解酶第10家族。

圖2 XynZT-3氨基酸序列進化樹分析

2.3 木聚糖酶三維結構建模

通過對蛋白質二級結構預測可知，木聚糖酶XynZT-3的二級結構主要由a-螺旋、無規則卷曲以及延展鏈構成，所占比例分別為22.55%、27.81%和41.66%。XynZT-3三維結構建模如圖3所示，XynZT-3具有GH10家族典型的“桶狀”結構特點。

圖3 XynZT-3同源建模三維結構

2.4 重組菌木聚糖酶SDS-PAGE分析及酶活力檢測

重組菌GS115／xynZT-3與預測目的蛋白分子量（107.0 kDa）相同位置處有明顯條帶，對照菌株GS115／pPIC9K在相應位置沒有目的條帶。發酵液酶活力檢測，重組菌GS115／xynZT-3發酵液能明顯檢測出木聚糖酶活力，而對照菌株GS115／pPIC9K發酵液中未檢測出木聚糖酶活力，說明重組菌成功表達了目的蛋白（圖4）。

圖4 重組菌木聚糖酶SDS-PAGE分析

2.5 重組菌發酵條件優化

圖5a可以看出，重組菌GS115／xynZT-3在12 h～30 h時間處于對數生長期，此時菌體生長迅速。溫度對重組菌相對酶活力的影響如圖5b，木聚糖酶活力隨著誘導溫度的升高呈現先升高后降低的趨勢。相對酶活力達到最高時，誘導溫度為16℃；當誘導溫度超過20℃時，重組酶相對酶活力急劇下降，僅能保持50%的相對酶活力。這可能由于低溫對畢赤酵母發酵過程中細胞物質及能量代謝有促進作用，可提高胞內醇氧化酶活力及能量水平［23］。

圖5c顯示：甲醇誘導濃度為1.50%時，重組菌相對酶活力最高；當甲醇誘導濃度大于2%時，重組菌相對酶活力急劇降低。這可能由于pPIC9K載體中有醇氧化酶（AOX I）基因的啟動子，屬于可利用甲醇的正常型菌株，低濃度的甲醇對重組菌有激活作用，可使相對酶活力增加，高濃度的甲醇對重組菌有抑制作用，可使相對酶活力降低［24］。圖5 d顯示重組菌最佳種齡為28 h時，這與圖5a生長曲線顯示重組菌培養28 h為對數生長期的末期，此時菌體活力強，菌體濃度大，適宜接種，結果相一致。

圖5e顯示：當誘導時間為4 d時，相對酶活力最高，當誘導時間大于5 d時，相對酶活力逐漸降低。這可能因為誘導時間過長，使菌體發生自溶，導致胞內蛋白降解被釋放出［25-27］。圖5-f顯示：重組木聚糖酶的相對酶活力隨著培養基pH值的升高呈現先升高后降低的趨勢。相對酶活力達到最高時，pH為4.0；當pH大于7.0時，相對酶活力急劇下降。這可能由于酶蛋白自身穩定性較差且在中性條件下酸性殘基的表面的空間分布不同，從而使相對酶活力下降［28-30］。

圖5 單因素優化最適條件

2.6 重組菌響應面實驗優化

響應面結果如表2所示。利用Design Expert軟件對響應面結果進行統計學分析，通過方差分析（表3）可知，在誤差允許范圍內，四個因素的影響P＞F，因此四個因素的影響是顯著的，具有統計學意義。通過最小二乘法法回歸方程得到重組菌GS115／xynZT-3產木聚糖酶的相對酶活力（Y）對于誘導溫度（X1）、甲醇濃度（X2）、種齡（X3）和pH（X4）的二次多項回歸模型：相對酶活力（Y）＝91.20-14.08X1-3.50X2-2.50X3＋1.58X4-1.25X1X2＋4.75X1X3-7.75X1X4＋2.25X2X3＋4.50X2X4＋4.50X3X4-24.14X12＋3.48X22-14.02X32-8.89X42。當變量為1時，線性擬合系數R2＝0.823 9，誤差平方和為0.647 9，擬合度良好。

表2 響應面實驗計劃表

表3 回歸模型方差分析結果

模型三維圖如圖6所示，四個因素在不同的水平對酶活力均能產生不同的影響，最大值處于三維圖的中心，模擬獲得最佳發酵條件誘導溫度16℃、甲醇濃1.50%、種齡28 h、pH3.7。在優化條件下，實際酶活力為4.212 U／mL，為預測值的87.5%，說明此回歸方程很好地反應了實際實驗情況。

圖6 響應面分析三維圖

3 結論

對麥氏交替單胞菌中木聚糖酶xynZT-3基因進行序列分析，結果顯示它屬于GH10家族。XynZT-3基因在畢赤酵母GS115中成功實現異源表達。對重組菌P．pastoris GS115／xynZT-3經單因素優化及響應面分析，在實驗室搖瓶條件下，重組菌最優表達條件為：誘導溫度16℃、甲醇濃1.50%、種齡28 h、pH3.7，培養6 d，在該條件下，重組酶活力為4.212 U／mL。本實驗是在實驗室水平上進行的，后續研究可以考慮在發酵罐中擴大培養并進行產酶條件的進一步優化。后續研究也將進一步探究重組酶的酶學特性，采用基因工程研究手段對該酶分子進行進一步的改造研究，以期能夠滿足食品工業的應用需求。