聚甘油酯對超聲制備酪蛋白酸鈉-米糠油乳液特性的影響

楊 波， 姚俊勝， 楊 光， 王劍宇

上海理工大學健康科學與工程學院，上海 200093

人造黃油賦予了烘焙食品特有的質地、風味和感官，但是人造黃油中含有大量的飽和脂肪酸甚至含有反式脂肪酸。由于過多的飽和脂肪酸和反式脂肪酸的攝入會出現(xiàn)肥胖及其他疾病，越來越多的消費者會傾向于低脂的烘焙產品。因此脂肪替代物的研究對于改變食品中脂肪含量和研發(fā)低脂食品具有重要意義［1］。乳液凝膠可以作為脂肪替代物來降低飽和脂肪酸含量，并提高食品中不飽和脂肪酸、人體必需氨基酸等含量［2］。一般來說，乳液凝膠的制備是通過一些方式來誘導乳狀液形成凝膠，所以制備好乳狀液是制備乳液凝膠的前提［3］。

聚甘油酯（PGFE）作為新型非離子乳化劑與其他乳化劑有較好的協(xié)同作用，具有良好的乳化分散性能，安全性高［4］，在中性、酸性和堿性環(huán)境中都相當穩(wěn)定，而且耐高溫性能好，所以被廣泛應用到烘焙食品中。酪蛋白酸鈉具有很強的乳化增稠作用，可以增進脂肪和水的保持力，蛋白質的特殊表面特性使得它們能夠吸附在油水界面上，形成一層厚厚的保護層，降低界面張力，它們作為有效的乳化劑，確保油滴在連續(xù)的水相中保持穩(wěn)定的狀態(tài)［4］。

目前關于聚甘油酯制備乳狀液的文獻很少，適宜的乳化劑組成對于乳狀液的特性及穩(wěn)定性也有重要影響。鑒于米糠油和酪蛋白酸鈉的高營養(yǎng)價值且米糠油和聚甘油酯具有較高的烘焙價值，本研究以米糠油為油相、以具有親油性的三聚甘油酯和酪蛋白酸鈉為乳化劑，利用超聲波制備乳狀液，通過測定界面蛋白吸附量、油滴粒徑及分布、黏度、乳析率、低場核磁和顯微鏡觀察來確定合適的乳化劑比例來制備乳化特性較好的乳狀液，并為之后制備乳液凝膠應用到烘焙食品中提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

食品級酪蛋白酸鈉（山東百思特食品健康有限公司），米糠油（浙江得樂康食品股份有限公司），聚甘油酯（山東濱州金盛新材料科技有限責任公司），其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

JY98-IIIDN超聲波破碎儀，上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司；DHR-1旋轉流變儀，沃特世科技（上海）有限公司；MGL-16M臺式高速冷凍離心機，美瑞克儀器（上海）有限公司；E200生物顯微鏡，尼康儀器（上海）有限公司；Brookhaven動態(tài)光散射儀；UPHIV-20TNP超純水機，四川優(yōu)普超純科技有限公司；LC-MSH-PRO磁力攪拌器，邦西儀器科技（上海）有限公司；AL204電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；NMI-20型低場核磁共振分析儀，蘇州紐邁科技股份有限公司；FV1200激光共聚焦顯微鏡，奧林巴斯（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 復合乳狀液的制備

在50 mL的燒杯中加入12 g米糠油，另取一個50 mL的燒杯加入8 g蒸餾水。酪蛋白酸鈉的質量為油水總質量的0.6%，聚甘油酯的質量分別為油水總質量的0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%。將酪蛋白酸鈉加入到蒸餾水中并封上保鮮膜加熱攪拌1 h，另一個裝有米糠油的燒杯中加入聚甘油酯也同時以相同的溫度加熱1 h，攪拌結束后將兩相混合，利用超聲波破碎儀進行超聲處理，超聲功率為240 W，超聲總時間為1 min 30 s（開4 s，關6 s），用1 mol／L的HCl和NaOH將制備好的乳液pH調至7，每個處理組做3個重復。

1.3.2 界面蛋白吸附量的測定

根據(jù)KEERATI-U-RAI［5］的方法稍作修改，制作的新鮮乳液在10 000 r／min離心30 min，并用注射器將下層清液吸出，測定清液中的蛋白質濃度。按照下面公式計算界面蛋白吸附量。

式中：C0表示乳液中初始蛋白濃度，g／mL，Cf表示離心后下層清液中的蛋白質濃度，g／mL。

1.3.3 平均粒徑及分布的測定

參照楊貴妃［6］的方法用超純水將待米糠油乳液稀釋1 000倍，使用激光粒徑儀測定米糠油乳液的粒徑，平衡時間為120 s，每組樣品測定3次，取平均值。

1.3.4 黏度的測定

采用流變儀測定乳液黏度，取適量米糠油乳液置于40 mm平板上，使其均勻分布。測試溫度25℃，剪切速率1 s-1～300 s-1，總剪切時間180 s。

1.3.5 乳析率的測定

取10 mL乳狀液樣品于帶刻度的離心管中，室溫下在3 000 g離心20 min，測定油析體積，按照下面公式計算出乳析率：

1.3.6 乳狀液的光學顯微鏡觀察

將制備好的新鮮乳液用攪拌棒拌勻，吸取1 mL乳液加入到10 mL的SDS溶液中，混勻后吸取10 μL滴到載玻片上，并蓋好蓋玻片。將制備好的樣片用光學顯微鏡觀察，選擇10倍目鏡，40倍物鏡觀察，選擇視野清晰，最具代表性的區(qū)域進行拍攝。

1.3.7 乳狀液的共聚焦顯微鏡觀察

參照KOO C K W［7］的方法，每個樣品（1 mL）均用熒光染料預染色（每種染料0.2 mL）。油用尼羅紅染色（在1 mL乙醇中1 mg尼羅紅），而蛋白用FITC（在1 mL二甲基亞砜中1 mg FITC）染色。將染色劑與樣品混合至少3秒鐘后，將一滴（0.1 mL）染色樣品吸移到顯微鏡載玻片上，并蓋上玻璃蓋玻片。尼羅紅的激發(fā)和發(fā)射波長分別為543 nm和605 nm，F(xiàn)ITC的激發(fā)和發(fā)射波長分別為488 nm和515 nm。

1.3.8 LF-NMR分析

參照劉聰慧［8］的方法，采用低場核磁共振分析儀NMI-20（磁場強度0.53 T，質子共振頻率22 MHz）分析乳液的T2弛豫行為，取待測樣品2.5 mL于核磁管中并在水浴鍋中32℃預熱10 min。選擇CPMG序列進行橫向弛豫時間（T2）檢測，具體參數(shù)為：NS＝8，TW＝2 000 ms，SW＝100 kHz。

2 結果與討論

2.1 乳狀液界面蛋白吸附量的分析

界面蛋白吸附量表示界面吸附蛋白的覆蓋率，是研究界面性質的一項重要指標［9］。

由圖1可知，隨著聚甘油酯添加量的增大，界面蛋白吸附量呈先增大后減小的趨勢。這是因為聚甘油酯濃度較低時，較多的酪蛋白吸附在界面上，此時的界面膜是酪蛋白主導。隨著聚甘油酯添加量的增多，聚甘油酯和酪蛋白存在競爭吸附作用，界面膜逐漸由酪蛋白主導變成聚甘油酯主導，導致部分酪蛋白被取代下來，所以界面蛋白吸附量降低。DE PILLI T等［10］發(fā)現(xiàn)許多小分子乳化劑在與蛋白質共同作用時，能夠將作用在乳狀液表面的蛋白質解吸下來，最終導致乳狀液最終由乳化劑穩(wěn)定。LI J F等［11］利用熒光光譜研究大豆蛋白和卵磷脂的結合機制時指出磷脂取代界面上部分蛋白質，從而形成蛋白和磷脂的混合界面。

圖1 聚甘油酯添加量對界面蛋白吸附量的影響

2.2 乳狀液平均粒徑及分布的分析

乳狀液的平均粒徑和粒徑分布是探究乳液乳化特性的一項重要指標，一般來說，乳狀液中的油滴平均粒徑越小，分散越均勻，表示乳化特性越好［12］。

圖2a表示的是不同聚甘油酯添加量的乳狀液的平均粒徑，隨著聚甘油酯添加量的增加，乳狀液的平均粒徑呈現(xiàn)減小趨勢。添加聚甘油酯的樣品的平均粒徑明顯小于對照組，添加0.2%（W／W）的聚甘油酯就可以將對照組的平均粒徑減小2.5μm左右。這可能是因為聚甘油酯和蛋白質同時作用在油滴表面，二者共同作用導致界面張力減小，因此界面自由能降低，平均粒徑減小。當聚甘油酯添加量增加時，作用在油水表面的聚甘油酯增多，乳化效果增強，所以乳狀液的平均粒徑減小［13］。

圖2 聚甘油酯添加量對乳液平均粒徑（左）及分布（右）的影響

乳狀液的粒徑分布圖如圖2b所示，樣品的粒徑分布均呈現(xiàn)出單峰，但是峰值不同。單峰分布表明乳狀液穩(wěn)定性較好［14］，表示乳狀液中顆粒大小相近且分布均勻。隨著聚甘油酯添加量的增加，峰逐漸變窄并向左移動，說明乳狀液中的油滴的粒徑在逐漸減小，并且油滴大小相近且均勻。因此，適量的聚甘油酯的加入會使酪蛋白與其較好的結合，能夠更好穩(wěn)定水、油界面的平衡，有助于提高蛋白的乳化能力和穩(wěn)定性。

2.3 乳狀液黏度的分析

乳狀液的黏度與液滴在體系中運動和遷移的速率有關，黏度大的乳液中連續(xù)相和分散相的流動性差，這樣有利于保持乳液的穩(wěn)定。

圖3 是乳狀液黏度在剪切率1 s-1至300 s-1的變化，隨著聚甘油酯添加量的增多，乳狀液的黏度逐漸增大，但是所有樣品的黏度均隨著剪切率的增加而降低。這種乳狀液呈現(xiàn)出剪切變稀的行為，說明了該乳狀液是非牛頓假塑性流體［15］。一般來說，乳液的黏度與油滴粒徑有關，油滴粒徑越小，乳狀液的黏度會越大。

圖3 聚甘油酯添加量對乳狀液黏度的影響

2.4 乳狀液的乳析率分析

由圖4可知，隨著聚甘油酯添加量的增加，乳析率呈先下降趨勢，當聚甘油酯添加量達到0.6%（W／W）時，乳析率趨于平穩(wěn)。王才華等發(fā)現(xiàn)乳狀液中油滴的粒徑是影響乳析率的主要因素，然后表觀粘度次之［16］。通過Stokes定律可知，乳狀液中分散的粒子與分散介質密度差越小、粒子的直徑越小，導致黏度變大，因此沉降速度變慢，乳析率減小，乳液的穩(wěn)定性增加。

圖4 聚甘油酯添加量對乳狀液乳析率的影響

2.5 光學顯微鏡觀察

乳液微觀結構的觀察可以直觀的表征乳液穩(wěn)定性［17］。

如圖5所示，隨著聚甘油酯添加量的增加，乳滴的尺寸逐漸變小，并且乳滴的分布和大小變得均勻。未添加聚甘油酯的乳狀液體系中存在較大的脂肪球，當添加了聚甘油酯，乳狀液體系中的大脂肪球的數(shù)目明顯減少，小脂肪球的數(shù)目增加。這是因為當聚甘油酯和酪蛋白共同作為乳化劑時，兩者在油水界面共存，產生了疏水相互作用和靜電相互作用，使乳狀液中的液滴分布更加均勻［18］，乳狀液的穩(wěn)定性增加。

圖5 不同聚甘油酯添加量的乳液微觀結構觀察（比例尺：20μm）

2.6 乳狀液共聚焦顯微鏡觀察

如圖6所示，a是未添加聚甘油酯的乳狀液，b是添加了0.6%（W／W）的聚甘油酯的乳狀液，聚甘油酯和米糠油被染成了紅色，蛋白質被染成了綠色。大量蛋白質吸附在油水界面，但由于光學顯微鏡的分辨率有限，這一點無法被看到，還有一部分蛋白質分散在水相中。添加0.6%（W／W）的聚甘油酯的樣品在共聚焦顯微鏡下的乳狀液的液滴明顯小于對照樣品。

圖6 乳狀液的共聚焦顯微圖

2.7 乳狀液LF-NMR弛豫行為分析

圖7 是不同聚甘油酯添加量的米糠油乳液的多組分弛豫圖譜，圖中每一種峰都代表一種狀態(tài)的氫質子。對照樣品中一共發(fā)現(xiàn)三個峰，分別是T22、T23、T24，添加了聚甘油酯的樣品中可以觀察到四個峰，分別是T21、T22、T23和T24。新的T21峰可能與聚甘油酯中的氫質子有關。T23占比最大，該峰與米糠油中的氫質子有關，而T24則代表水中的氫質子。

圖7 聚甘油酯添加量對乳狀液的多組分弛豫圖譜的影響

弛豫時間可以為油和蛋白質的分子動力學提供重要信息，與油滴的流動性和乳狀液的結構有關。因此，低場核磁共振T2值提供了油滴流動性的信息，較短的值表明更受限制的運動［19］。對照的T23峰相對較短，可能是單一的酪蛋白乳化效果沒有復配的好，所以油滴較大，導致油滴流動性差。隨著聚甘油酯的添加，峰值逐漸變小，這可能是因為乳狀液黏度變大，流動水減少。聚甘油酯主要通過降低油水界面張力形成乳液，聚甘油酯為氫質子提供了更大的旋轉和運動空間，因此其T2弛豫時間較長。

3 結論

在聚甘油酯添加量為0.2%～0.4%（W／W）條件下制備的乳狀液具有較多的界面蛋白含量，并且降低了界面張力，提高了乳化穩(wěn)定性。然而，當聚甘油酯添加量增至0.6%（W／W）時，界面蛋白吸附量降低，不利于蛋白質的利用。

聚甘油酯的添加使油滴的粒徑分布更加均勻，添加0.2%（W／W）的聚甘油酯就可以使乳狀液油滴的平均粒徑降低2.5μm左右。隨著聚甘油酯添加量的增加，乳狀液的黏度逐漸變大，乳析率降低，當添加量達到0.6%（W／W）時乳析率比未添加降低了大約15%，提升了乳液的穩(wěn)定性。通過低場核磁的T2弛豫時間的分析得出聚甘油酯的添加增加了油滴的流動性。

聚甘油酯的復合及添加比例對乳狀液會產生一定的影響，適量添加聚甘油酯會明顯改善酪蛋白酸鈉-米糠油乳液的乳化特性，為之后研究乳液凝膠來代替人造黃油提供理論基礎。