以3CLpro為靶標的抗SARS-CoV-2藥物的虛擬篩選

王祥聰， 汪忠華,2， 程利平， 吳范宏,2

（1. 上海應用技術大學 化學與環境工程學院，上海 201418；2. 上海綠色氟代制藥工程技術研究中心，上海 201418）

冠狀病毒不僅會在野生動物中傳播，而且還可能導致人類患病[1]。在過去的二十年中，冠狀病毒已有2次大規模的大流行，即嚴重急性呼吸綜合征（severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS）和中東呼吸綜合征（Middle East respiratory syndrome, MERS）[2-3]。有充分的科學研究表明，野生動物體內早已儲存多種冠狀病毒[4-8]，可能具有人畜共患的特點[9]，其中某些病毒可能引起大規模流行病的暴發[10-11]。2019年12月，湖北省武漢市發現了一種嚴重的呼吸系統疾病[12]。2020年2月11日，世界衛生組織宣布，將此種新型冠狀病毒肺炎命名為“COVID-19”（Corona Virus Disease 2019）；而國際病毒分類委員會將新型冠狀病毒命名為“SARS-CoV-2”[13]。作為一種RNA病毒，盡管與其他冠狀病毒一樣，由于基因組編碼的核酸外切酶使其突變率可能比其他RNA病毒低一些，但COVID-19仍具有高突變率的固有特征[14]。對完整病毒基因組的29 903個核苷酸進行系統化分析，結果表明，該病毒與1組SARS樣冠狀病毒最為相似，相似度高達89.1%，且全基因組水平與蝙蝠冠狀病毒有96%相同[15]。用于CoV物種分類的ORF1ab中的7個保守復制酶結構域的氨基酸序列在COVID-19和SARS-CoV之間具有94.4%的同一性，表明這2種病毒同屬于SARSr-CoV[16]。無論是SARS-CoV還是MERS-CoVs基因組中都包含2個開放閱讀框ORF1a和ORF1b，它們被宿主核糖體翻譯成2個各自的病毒多聚蛋白pp1a和pp1ab。在冠狀病毒中，有1個重要的藥物靶標是3C蛋白酶（3CLpro），其在處理從病毒RNA翻譯而來的多聚蛋白的過程中起著重要作用[17]。3CLpro是一種半胱氨酸蛋白酶，具有高度保守的三維結構，由ORF1a編碼。3CLpro負責切割多聚蛋白后11個位置，從而導致SARS-CoV和MERSCoVs中總共釋放16種非結構蛋白。3CLpro的同型二聚體形式在底物存在下具有活性。3CLpro的晶體結構顯示每個單體均由3個結構域組成：2個結構域與催化半胱氨酸形成胰凝乳蛋白酶樣結構，并通過長環連接至第3個C末端結構域[18]。對于蛋白水解位點，在P1位置的3CLpro偏愛使用谷氨酰胺，在P2、P3和P4位置的分別使用亮氨酸、堿性殘基和小的疏水殘基；在P10和P20位置的使用小的疏水殘基，但在P30位置的沒有強烈的偏好[19]。自動裂解過程對于病毒繁殖至關重要，因此3CLpro是抗冠狀病毒感染的良好藥物靶標。

在這場發展迅速的新冠肺炎疫情中，各類中西藥起到了重要的治療作用。選取部分抗病毒中藥、抗病毒西藥以及課題組內合成的化合物，基于3CLpro為靶點進行分子對接，虛擬篩選出抗COVID-19病毒活性較高的中西藥，為治療新型冠狀病毒提供可能的候選藥物。

1 虛擬實驗方法

1.1 3CLpro 靶點分子對接模型構建

在蛋白數據庫網站RSCB（http://www.rcsb.org）下載SARS-CoV-2冠狀病毒的3CLpro蛋白結構（PDB ID:6LU7），該蛋白的三維結構由上?？萍即髮W饒子和/楊海濤課題組發布。使用Sybyl軟件先除去蛋白結構中的配體、水分子，加氫和分配相關電荷等，再對蛋白進行能量優化。

1.2 小分子配體庫的建立

將所有的小分子轉化成MOL2格式文件，使用Sybyl軟件進行能量優化，使能量最小，并建立優化后的分子表單。

1.3 小分子配體庫與受體蛋白的分子對接

基于1.1構建的三維結構模型，利用SYBYL軟件中的Surflex-Dock模塊，根據配體分子結構定義3CLpro分子的活性口袋。通過1.2構建的分子表單利用SYBYL軟件中的 Surflex-Dock （SFXC）進行分子高精度分子對接。

2 結果與討論

2.1 配體小分子虛擬篩選結果

配體小分子虛擬篩選結果如表1所示。打分值（total score）是分子對接中最重要的一項指標，當total score＞4，小分子被認為是相應受體蛋白的特異性配體[20]，當total score＞6，小分子被認為是能與相應的受體產生相互作用[21]。共有14個小分子的total score＞6。其中Sit-144和Remdesivir的total score相對較高，分別為8.941 3和8.047 1，且Sit-144的total score（8.941 3）高于原始蛋白配體的（8.474 1）。Crash為配體進入蛋白質的不適當侵入的程度和配體原子之間的不恰當自我沖突，值越趨近于0越好；Polar為氫鍵和鹽橋相互作用對總得分的貢獻；Similarity為對接分子和配體之間相似性打分。

表1 （續）

表1 （續）

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表1 （續）

表1 （續）

表1 （續）

表1 小分子對接結果Tab. 1 Docking results of small molecules

2.2 分子對接分析

由于Sit-144打分值最高且高于原始蛋白配體，而Remdesivir在實際治療中表現出了抗新型冠狀病毒活性，所以以 Sit-144與 Remdesivir為例，分析配體小分子與3CLpro靶點間的相互作用（氫鍵及其鍵長、疏水作用等）。

如圖1所示，Sit-144的磷酰胺鍵上的氨基與Gln189形成氫鍵，鍵長為0.211 nm。伯氨基和Met49和Asp187形成氫鍵，鍵長分別為0.228 nm和0.233 nm。酯上的碳氧雙鍵與Glu166形成氫鍵，鍵長為0.218 nm。磷酸酯上無取代苯環與Leu27與Cys145形成疏水相互作用，距離分別為0.522 nm和0.428 nm。

圖1 Sit-144與 SARS-CoV-2 3CLpro蛋白酶的結合模式Fig. 1 The binding mode of Sit-144 and SARS-CoV-2 3CLpro protease

如圖2所示，Remdesivir三嗪環上的伯氨和Asn142形成氫鍵，鍵長為0.291 nm。四氫呋喃環上氧原子與Thr26形成氫鍵，鍵長為0.211 nm。磷酰基團上的羰基與Cys145上的巰基和伯氨基形成2個氫鍵，鍵長為分別為0.217 nm和0.256 nm。羧酸酯鏈上的兩端的甲基分別同Met165、Met49與His41形成疏水作用，距離分別為 0.437 nm、0.342 nm和0.411 nm。

圖2 Remdesivi與SARS-CoV-2 3CLpro蛋白酶的結合模式Fig. 2 The binding mode of Remdesivi and SARS-CoV-2 3CLpro protease

Sit-144和Remdesivi 同3CLpro蛋白酶形成的氫鍵數目均為4個，Sit-144同3CLpro蛋白酶形成的疏水作用弱于Remdesivi 同3CLpro蛋白酶之前的疏水作用，可能是Sit-144打分值高于Remdesivi的原因。

3 結 語

針對新冠肺炎這種全球大流行傳染病，基于現有的抗病毒中西藥以及課題組內合成的小分子（共75種結構），進行虛擬篩選，使用3C蛋白酶進行分子對接。當total score＞4，小分子被認為是相應受體蛋白的特異性配體，當total score＞6，小分子被認為是能與相應的受體產生相互作用。分子對接中共有61個小分子total score＞4，14個小分子total score＞6。其中Sit-144和還在臨床試驗中的Remdesivir的total score最高，分別為8.941 3和8.047 1，并且Sit-144高于Remdesivir，說明Sit-144對于SARS-CoV-2的抗病毒活性可能要高于Remdesivir。本研究為新冠肺炎相關藥物的選擇提供一些參考。