Box-Behnken 響應(yīng)面設(shè)計(jì)聯(lián)合LS-SVM 數(shù)學(xué)模型優(yōu)化經(jīng)典名方滌痰湯的有效成分提取工藝

陳思邈 李旭冉 張宇燕 金偉鋒 陶水良 丁志山 陳偉燕

浙江中醫(yī)藥大學(xué) 杭州 310053

滌痰湯源于明代《奇效良方》，組分包含膽南星、橘紅、石菖蒲、茯苓、枳實(shí)等9味藥[1]，具有滌痰開竅、利氣補(bǔ)虛之功效，能開竅醒神治其標(biāo)；同時(shí)補(bǔ)氣滲濕化痰，使?jié)駸o所聚，痰無所生，以固其本[2]，主治中風(fēng)、痰迷心竅、舌強(qiáng)不能言。 臨床加減化裁后常用于中風(fēng)[3]、抑郁[4]、癡呆[5]，以及冠心病[6]、肺部疾病[7-8]等屬于痰涎壅盛的疾病的治療， 均取得了較好的臨床療效。現(xiàn)代臨床用藥通常保留經(jīng)典滌痰湯組方中橘紅、枳實(shí)、石菖蒲等組分[9-12]。研究也表明這些延用藥物及其有效成分均具有較強(qiáng)的藥理作用，如橘紅、枳實(shí)中的辛弗林、新橙皮苷等能促進(jìn)脂質(zhì)代謝[13-14]；橙皮苷具有抗病毒、抗菌、消炎、抗氧化等作用[15]，石菖蒲揮發(fā)油中的α-細(xì)辛醚、β-細(xì)辛醚等能顯著抗栓塞，保護(hù)心肌、血管細(xì)胞，改善血管功能等[16]。這些活性物質(zhì)在復(fù)方療效中起了重要作用，在中藥材、中藥提取物、中藥制劑研究中常作為指標(biāo)性成分，用于作用機(jī)制和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立控制研究。為深入開展對經(jīng)典名方滌痰湯的開發(fā)研究， 本研究選用方中具有較強(qiáng)生物活性，并作為藥品質(zhì)量控制指標(biāo)性成分的辛弗林、 橙皮苷、新橙皮苷、α-細(xì)辛醚、β-細(xì)辛醚的總提取量為評價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化滌痰湯提取工藝，為進(jìn)一步開展古代經(jīng)方中藥復(fù)方制劑的制劑工藝和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定基礎(chǔ)。

響應(yīng)面設(shè)計(jì)在優(yōu)化中藥制劑提取工藝方面廣泛運(yùn)用，能有效優(yōu)化提取工藝條件，減少實(shí)驗(yàn)次數(shù)，提高效率。 支持向量機(jī)（support vector machine，SVM）是建立在統(tǒng)計(jì)學(xué)基礎(chǔ)上的數(shù)學(xué)模型，特別適用于復(fù)雜的中小型數(shù)據(jù)集分類，能有效解決非線性及高維模式識(shí)別問題。 而最小二乘支持向量機(jī)（least squares-support vector machine，LS-SVM）由SVM改進(jìn)而來[17]，將不等式約束變?yōu)榈仁郊s束， 使算法的復(fù)雜度大大減小[18]。本研究采用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，以滌痰湯中5個(gè)成分的總提取量為指標(biāo)， 聯(lián)合LS-SVM數(shù)學(xué)模型，以期更有效地優(yōu)化滌痰湯提取工藝。

1 材料和方法

1.1 儀器 Waters e2695高效液相色譜系統(tǒng)和Empower軟件購于美國沃特世公司；FA2104型電子分析天平購于上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；JP-040超聲波清洗機(jī)購于深圳潔盟清洗設(shè)備有限公司；Milli-Q Integral超純水儀購于德國默克密理博公司；Matlab 2015b軟件為美國邁斯沃克軟件公司產(chǎn)品。

1.2 藥物和試劑 姜半夏、麩枳實(shí)、茯苓、化橘紅、石菖蒲、黨參、竹茹均購于浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片有限公司（批號：200701、200801、200801、200901、200701、200901、200201），甘草、膽南星均購于浙江中醫(yī)藥大學(xué)杭州濱江門診部（批號：20201028、20210401），均符合2020年版中國藥典（一部）相應(yīng)藥材項(xiàng)下的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求；橙皮苷對照品、新橙皮苷對照品均購于上海源葉生物科技有限公司（批號：Z31J6L2067、M03J8S39169）；辛弗林對照品、α-細(xì)辛醚對照品、β-細(xì)辛醚對照品均購于成都曼思特生物科技有限公司 （批號：MUST-19101716、MUST-20051401、MUST-19112611）； 甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）均購于美國天地有限公司（批號：21075219、21075218）；無水乙醇（分析純）購于杭州雙林化工試劑有限公司（批號：20210915）；磷酸（分析純） 購于深圳西隴科學(xué)股份有限公司（批號：1708301）；水為超純水。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱為SunFire C18柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，4%A；5～10 min，4%A→20%A；10 ～25 min，20%A →30%A；25 ～40 min，30%A →60%A；40～45 min，60%A→65%A）， 流速1 mL·min-1，進(jìn)樣量10 μL，柱溫30 ℃，波長220 nm。

1.3.2 溶液制備

1.3.2.1 對照品溶液制備 精密稱取各對照品適量，以甲醇定容至5 mL， 得到質(zhì)量濃度分別為0.800、10.000、10.000、1.200、0.200 mg·mL-1的辛弗林、 橙皮苷、新橙皮苷、β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚儲(chǔ)備液。精密量取上述儲(chǔ)備液，混勻后加甲醇并定容至5 mL，制成質(zhì)量濃度分別為0.096、1.200、1.200、0.144、0.024 mg·mL-1的混合對照品溶液。

1.3.2.2 供試品溶液制備 按滌痰湯處方比例稱取50 g藥材粉末，過40目篩，加10倍80%乙醇，55 ℃超聲提取60 min，0.22 μm微孔濾膜過濾， 得到供試品溶液。

1.3.3 測定方法建立

1.3.3.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別吸取1.3.2.1和1.3.2.2項(xiàng)下的混合對照品溶液和供試品溶液適量，按1.3.1項(xiàng)下色譜條件分析。

1.3.3.2 線性關(guān)系考察 分別吸取1.3.2.1項(xiàng)下儲(chǔ)備液，以甲醇梯度稀釋制成辛弗林、橙皮苷、新橙皮苷、β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚5種成分系列梯度的對照品溶液， 然后按1.3.1項(xiàng)下色譜條件分析， 分別對峰面積（Y）和質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程。

1.3.3.3 精密度試驗(yàn) 取同一濃度的混合對照品溶液，按1.3.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)6次進(jìn)樣分析，記錄5個(gè)主要成分的峰面積， 計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）值。

1.3.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品6份，按1.3.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按1.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄5個(gè)主要成分的峰面積，計(jì)算RSD值。

1.3.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取樣品適量， 按1.3.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫放置，分別于0、1、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣分析，計(jì)算5個(gè)主要成分峰面積的RSD值。

1.3.3.6 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的供試品6份，每份50 g，按1.3.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，加入含辛弗林、橙皮苷、新橙皮苷、β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚質(zhì)量濃度分別為0.096、1.200、1.200、0.144、0.024 mg·mL-1的混合對照品溶液，分別進(jìn)樣分析，記錄峰面積并計(jì)算5個(gè)主要成分的平均加樣回收率及RSD值。

1.3.4 滌痰湯提取工藝的單因素實(shí)驗(yàn) 根據(jù)現(xiàn)代中藥制劑工藝研究要求，制劑制備研究需要根據(jù)其藥效物質(zhì)合理有效制定其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，有助于按照國家新藥申報(bào)要求開展規(guī)范開發(fā)。 中藥及其復(fù)方制劑在制備提取過程中溶劑濃度、液料比、提取時(shí)間、提取溫度、提取次數(shù)、pH值等是影響制劑質(zhì)量和藥效的重要因素[19-20]。 其中，溶劑被認(rèn)為是一個(gè)重要參數(shù)，它直接影響有效物質(zhì)的溶解度。 結(jié)合藥品安全性要求和現(xiàn)代制劑工藝制備規(guī)范要求，中藥制劑常以水和不同濃度的乙醇作為溶劑，本研究根據(jù)滌痰湯中各指標(biāo)成分的理化性質(zhì)特點(diǎn)，根據(jù)相似相溶原理，采用乙醇作為提取溶劑，并結(jié)合文獻(xiàn)[21-23]和預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選取乙醇濃度、液料比、提取時(shí)間、提取溫度、提取次數(shù)等影響較大的幾個(gè)因素，采用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)合理的水平，優(yōu)化滌痰湯的制劑制備工藝。

按照滌痰湯處方比例分別精密稱取每份樣品50 g，過40目篩，固定其他因素不變，以單因素乙醇濃度、液料比、提取時(shí)間、提取溫度、提取次數(shù)不同水平的實(shí)驗(yàn)條件下制備各供試品溶液，分別測定滌痰湯中5個(gè)主要成分的濃度，并計(jì)算提取量（mg·5g-1），考察各影響因素的不同水平對滌痰湯主要成分總提取量的影響。

1.3.5 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化滌痰湯提取工藝 以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，同時(shí)考慮到提取次數(shù)對提取率的影響不大，本研究選取乙醇濃度（A）、液料比（B）、提取時(shí)間（C）、提取溫度（D）為因素，通過Design-Expert軟件進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)。

1.3.6 LS-SVM優(yōu)化滌痰湯提取工藝

1.3.6.1 模型的仿真及參數(shù)尋優(yōu) 利用LS-SVM，以等式約束替代原來的不等式約束，在保證精度的前提下， 將復(fù)雜的非線性問題轉(zhuǎn)化為對線性矩陣的求解[24]。 利用Matlab 2015b軟件，以乙醇濃度（x1）、液料比（x2）、提取時(shí)間（x3）、提取溫度（x4）為4個(gè)提取工藝數(shù)據(jù)，設(shè)滌痰湯中5種有效成分辛弗林、橙皮苷、新橙皮苷、β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚的總提取量為Y?？紤]數(shù)據(jù)量，本研究采用形式簡單、非線性逼近能力強(qiáng)的徑向基核函數(shù)（radial basis function，RBF）[25]，同時(shí)確定核參數(shù)g和懲罰因子C，以使LS-SVM模型最優(yōu)化。 兩者與樣本密切相關(guān)，C值代表了對誤差的寬容度，C值越大，允許的誤差越小，但C值過大會(huì)導(dǎo)致過擬合；C值越小則使模型泛化能力增加，同時(shí)對誤差的容忍度也越大。核參數(shù)g則與樣本的輸入范圍呈正相關(guān)，范圍越大核參數(shù)g取值就越大，反之則相應(yīng)減小。

1.3.6.2 條件尋優(yōu)及結(jié)果預(yù)測 得到最優(yōu)核參數(shù)和懲罰因子后，重新利用LS-SVM模型，得到主要成分總提取量預(yù)測值。 將實(shí)際值和預(yù)測值進(jìn)行分析對比， 進(jìn)一步驗(yàn)證預(yù)測結(jié)果的可信度。 最后根據(jù)Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)合制劑工藝實(shí)際，通過Matlab 2015b軟件梯度增設(shè)待預(yù)測數(shù)據(jù)集， 利用LS-SVM模型進(jìn)行最優(yōu)條件的預(yù)測。

1.3.6.3 工藝驗(yàn)證 按照LS-SVM模型預(yù)測的最優(yōu)條件進(jìn)行5次平行試驗(yàn)，測定5種成分辛弗林、橙皮苷、新橙皮苷、α-細(xì)辛醚、β-細(xì)辛醚的總提取量平均值以及RSD值，并與預(yù)測值相比較，計(jì)算相對誤差以驗(yàn)證其可靠性。

2 結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)結(jié)果 將混合對照品溶液和供試品溶液進(jìn)樣后結(jié)果表明，供試品溶液色譜圖中5種主要成分色譜峰的保留時(shí)間與混合對照品的保留時(shí)間相同，待測成分與其他色譜峰可實(shí)現(xiàn)基線分離，分離度＞1.5。 見圖1。

圖1 空白樣品、混合對照品和滌痰湯的HPLC圖Fig.1 HPLC diagram of blank sample， mixed reference and Ditan Decoction

2.2 線性關(guān)系考察結(jié)果 將辛弗林、橙皮苷、新橙皮苷、β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚5種成分系列梯度的對照品溶液進(jìn)樣分析，分別以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合，得到回歸方程，說明5個(gè)對照品在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。 見表1。

表1 回歸方程和相關(guān)系數(shù)Tab.1 Regression equation and correlation coefficient

2.3 精密度試驗(yàn)結(jié)果 取同一濃度的混合對照品溶液， 連續(xù)6次進(jìn)樣，5個(gè)主要成分的峰面積RSD值分別為1.59%、0.48%、0.41%、0.71%和0.69%， 表明儀器精密度良好。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 取同一批樣品6份，制備供試品溶液后進(jìn)樣分析， 計(jì)算得到5個(gè)主要成分的峰面積RSD值分別為1.48%、0.70%、0.51%、0.81%和1.23%，表明方法重復(fù)性良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 制備供試品溶液，室溫放置，分別于0、1、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣分析， 結(jié)果5個(gè)主要成分峰面積RSD值分別為1.98%、1.53%、0.84%、1.34%和1.66%，表明制備的供試品溶液在12 h內(nèi)較穩(wěn)定。2.6 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果 取已知含量的供試品6份，制備供試品溶液，加入已知質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，記錄峰面積，計(jì)算得到5個(gè)主要成分的平均加樣回收率分別為97.53%、102.47%、99.72%、104.52%和98.09%，RSD值分別為1.79%、1.28%、1.64%、1.90%和1.58%，表明該方法準(zhǔn)確性良好。

2.7 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.7.1 乙醇濃度對提取效果的影響 液料比為10:1（mL·g-1），提取溫度為55 ℃，提取時(shí)間為60 min時(shí)，分別檢測乙醇濃度35%、50%、65%、80%、95%對主要成分提取量的影響。見圖2a。結(jié)果表明，乙醇濃度為50%時(shí)提取效果最好。

2.7.2 液料比對提取效果的影響 乙醇濃度為50%，提取溫度為55 ℃，提取時(shí)間為60 min時(shí)，分別檢測液料比6:1、8:1、10:1、12:1、14:1（mL·g-1）對主要成分提取量的影響。見圖2b。結(jié)果表明，當(dāng)液料比為10:1（mL·g-1）時(shí)，提取效果最好。

2.7.3 提取時(shí)間對提取效果的影響 乙醇濃度為50%，液料比為10:1（mL·g-1），提取溫度為55 ℃時(shí)，分別檢測提取時(shí)間為45、60、75、90、105 min對主要成分提取量的影響。見圖2c。結(jié)果表明，提取時(shí)間為90 min時(shí)，提取效果最好。

2.7.4 提取溫度對提取效果的影響 乙醇濃度為50%，液料比為10:1（mL·g-1），提取時(shí)間為90 min時(shí)，分別檢測提取溫度45、55、65、75、85 ℃對主要成分提取量的影響。見圖2d。結(jié)果表明，提取溫度為65 ℃時(shí)，提取效果最好。

2.7.5 提取次數(shù)對提取效果的影響 乙醇濃度為50%，液料比為10:1（mL·g-1），提取溫度為65 ℃，提取時(shí)間為90 min時(shí)， 分別檢測提取1、2、3、4次對主要成分提取量的影響。見圖2e。結(jié)果表明，隨著提取次數(shù)的增加，提取的主要成分的總含量增加，但當(dāng)提取次數(shù)大于3次時(shí)，增勢變緩。

圖2 不同因變量對5種主要成分總提取量的影響Fig.2 Effects of different dependent variables on the total extraction volume of the five main components

2.8 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果 以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，選取乙醇濃度（A）、液料比（B）、提取時(shí)間（C）、提取溫度（D）為因素，進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)，按照四因素三水平分別稱取藥材50 g，共運(yùn)行試驗(yàn)30次，因素及水平和實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2、3。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素及水平Tab.2 Factors and levels of Box-Behnken experimental design

2.9 LS-SVM優(yōu)化滌痰湯提取工藝結(jié)果

2.9.1 模型的仿真及參數(shù)尋優(yōu)結(jié)果 通過Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)得到30組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。 以30行4列的輸入變量矩陣和30行1列的輸出變量矩陣替代原本30行5列的數(shù)據(jù)矩陣，導(dǎo)入Matlab 2015b軟件（因素水平值代替輸入變量）。 為了更容易正確收斂得到最優(yōu)解，對樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，再用Matlab 2015b軟件編程以及LS-SVM建模，同時(shí)采用RBF函數(shù)，最后采用交叉驗(yàn)證方法得到最優(yōu)核參數(shù)g為2.5， 最優(yōu)懲罰因子C為1.5。 見圖3。

圖3 最優(yōu)參數(shù)結(jié)果圖Fig.3 Result graph of optimal parameters

2.9.2 預(yù)測結(jié)果及分析 得到最優(yōu)核參數(shù)和懲罰因子 后， 重 新 利 用LS-SVM 模 型， 可 以 得 到30 組Box-Behnken Design分析方案的主要成分總提取量預(yù)測值。 見表4。

表4 LS-SVM模型的指標(biāo)成分總提取量預(yù)測值Tab.4 Predicted value of total extraction amount of index components of LS-SVM model （mg·5g-1）

利用均方誤差 （mean-square error，MSE） 評估LS-SVM模型性能，公式如下：

表3 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.3 Box-Behnken experimental design and results

其中，n表示數(shù)據(jù)集組數(shù)，yi表示LS-SVM預(yù)測值，表示實(shí)際值。

最后將30組實(shí)際值和預(yù)測值代入上述公式計(jì)算得MSE=23.88，得到實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和模型預(yù)測數(shù)據(jù)分析對比圖。見圖4。表明30組實(shí)際和預(yù)測的總提取量都很接近，進(jìn)一步表明模型仿真成功，擬合接近實(shí)際試驗(yàn)數(shù)據(jù)，預(yù)測效果可信。

圖4 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和模型預(yù)測數(shù)據(jù)分析對比圖Fig.4 Comparison chart of experimental data and model prediction data analysis

2.9.3 模型的條件尋優(yōu)及結(jié)果預(yù)測 根據(jù)Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)合制劑工藝實(shí)際， 通過Matlab 2015b軟件梯度增設(shè)88組待預(yù)測數(shù)據(jù)集，利用LS-SVM模型進(jìn)行最優(yōu)條件的預(yù)測。 最終得到最優(yōu)的提取條件是：乙醇濃度55%、液料比10:1（mL·g-1）、提取時(shí)間88 min、提取溫度65 ℃，在此最優(yōu)條件下預(yù)測指標(biāo)成分總提取量為166 mg·5g-1。

2.9.4 滌痰湯最優(yōu)提取條件的工藝驗(yàn)證結(jié)果 按照模型預(yù)測的最優(yōu)提取工藝進(jìn)行5次平行試驗(yàn)，測定5種成分辛弗林、橙皮苷、新橙皮苷、α-細(xì)辛醚、β-細(xì)辛醚的總提取量平均值為166.958 mg·5g-1（RSD值為0.28%）。見表5。 與預(yù)測值166 mg·5g-1比較， 相對誤差為0.57%，說明實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測值吻合度高，預(yù)測的滌痰湯最優(yōu)提取工藝真實(shí)、可信。

表5 按照優(yōu)化工藝進(jìn)行的5次平行試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Results of 5 parallel tests carried out according to the optimized process （n=5， mg·5g-1）

3 討論

古代經(jīng)方作為中醫(yī)處方的典型代表，是中醫(yī)藥傳承的重要手段，也是中醫(yī)學(xué)代代相傳的歷史瑰寶。 近年來，有關(guān)中藥提取工藝的研究逐漸增多，但多以單味藥為主。眾所周知，中藥中多組分配伍、多種有效成分的相互作用才是其發(fā)揮藥效的根本，這使得中藥成分研究與臨床復(fù)方用藥實(shí)際脫節(jié)，違背了中藥研究的整體性思想[26]。 因此，探索復(fù)方的提取工藝優(yōu)化十分有必要。新版的中藥新藥注冊辦法分四類進(jìn)行注冊申報(bào)，分別是中藥創(chuàng)新藥、中藥改良型新藥、古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑、同名同方藥。 結(jié)合現(xiàn)代中藥制劑工藝申報(bào)對質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立的規(guī)范性要求，需要根據(jù)藥效指標(biāo)成分開展中藥復(fù)方制劑工藝的全面研究。滌痰湯作為傳統(tǒng)經(jīng)方，現(xiàn)可考其源于溫膽湯和導(dǎo)痰湯，方中半夏、竹茹、枳實(shí)、橘紅燥濕降氣化痰、清熱除煩；膽南星善化風(fēng)痰；石菖蒲具有豁痰開竅、醒神定志之效；茯苓、甘草補(bǔ)氣滲濕，使?jié)駸o所聚，痰無所生，以固其本， 凡痰濁閉阻、 氣機(jī)失暢所致的疾病均適用此方[1]。 經(jīng)歷代醫(yī)學(xué)名家朱丹溪、汪昂、沈金鰲等的加減應(yīng)用和演化，擴(kuò)大了該方臨床應(yīng)用范圍[27]，但其作用機(jī)制及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)還未深入研究，迫切需要基于中醫(yī)整體思維明確其療效物質(zhì)，同時(shí)對其有效物質(zhì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。本研究引用了現(xiàn)代數(shù)學(xué)建模的思路方法，可用于滌痰湯以及其他經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑的開發(fā)研究，有助于建立制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

響應(yīng)面設(shè)計(jì)是一種運(yùn)用廣泛的試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化方法，大大減少試驗(yàn)次數(shù)，直接考察影響因素之間的交互作用[28]。 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)在中藥提取方面的應(yīng)用已較為普遍，能有效優(yōu)化工藝條件，提高生產(chǎn)效益。 但響應(yīng)面優(yōu)化法也存在其局限性，當(dāng)變量個(gè)數(shù)比較多以及模型存在很強(qiáng)的非線性時(shí)，尋找合適的優(yōu)化設(shè)計(jì)會(huì)非常困難[29]。 所以在使用響應(yīng)面設(shè)計(jì)之前，必須確定合理的影響因素與水平，設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)應(yīng)包括最佳實(shí)驗(yàn)條件，這就對前期數(shù)據(jù)提出較高要求。 本研究考察了乙醇濃度、液料比、提取時(shí)間、提取溫度以及提取次數(shù)對有效成分總提取量的影響， 結(jié)果表明乙醇濃度、液料比、提取時(shí)間和提取溫度對提取效果的影響更為顯著，同時(shí)得到了因素的最優(yōu)水平。以單因素實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)， 四因素三水平為實(shí)驗(yàn)點(diǎn)， 利用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)有效運(yùn)行實(shí)驗(yàn)30次。

LS-SVM模型能將小數(shù)量樣本、高維度等特征問題有效分類[30]，降低復(fù)雜度，增加求解速度，預(yù)測能力強(qiáng)、精度高，在回歸估計(jì)、模式識(shí)別、控制理論以及非線性預(yù)測等方面運(yùn)用廣泛[31]。RBF函數(shù)具有良好的泛化能力和較快的學(xué)習(xí)收斂能力， 可將多維問題轉(zhuǎn)化為一維問題[32]。 MSE被用來反映估計(jì)量與被估計(jì)量之間的差異程度，值越小，說明模型擬合的精確度越高。本研究在單因素實(shí)驗(yàn)和Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)基礎(chǔ)上，將實(shí)驗(yàn)結(jié)果聯(lián)合LS-SVM模型，同時(shí)采用RBF函數(shù)， 分析預(yù)測滌痰湯的提取工藝。 結(jié)果提示MSE=23.88，表明擬合效果良好，進(jìn)一步預(yù)測最優(yōu)提取條件為：乙醇濃度55%、液料比10:1（mL·g-1）、提取時(shí)間88 min、 提取溫度65 ℃，5種指標(biāo)成分總提取量實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測值相對誤差為0.57%， 證明該模型真實(shí)、可信。

LS-SVM模型因其顯著優(yōu)勢成為繼神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)之后的研究熱點(diǎn)，但其在中藥提取方面的運(yùn)用還有待于進(jìn)一步研究。 本研究通過Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)聯(lián)合LS-SVM模型預(yù)測，優(yōu)化了滌痰湯的制劑提取工藝，經(jīng)驗(yàn)證分析其具有較好的擬合預(yù)測效果。本研究結(jié)果為滌痰湯的開發(fā)奠定了較好的基礎(chǔ)，有助于深入研究滌痰湯及其制劑的作用機(jī)制，同時(shí)也證實(shí)Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)聯(lián)合LS-SVM模型在優(yōu)化中藥復(fù)方制劑提取工藝上具有較好的有效性、實(shí)用性，為中藥新藥開發(fā)、制劑工藝研究提供了創(chuàng)新性方法。

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