牛蒡子苷對ARDS 細胞模型的抗炎作用及PI3K-AKT-NF-кB 信號通路的影響

宋天然 陳芳 董泉明 姚欽 冉小琴 屠思懿 姜望宇

浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 杭州 310003

急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS） 是在嚴重感染休克及創(chuàng)傷過程中，肺毛細血管內(nèi)皮細胞及肺泡上皮細胞損傷， 造成彌漫性肺間質(zhì)及肺泡嚴重水腫導(dǎo)致的急性低氧血癥和呼吸衰竭， 是肺部疾病發(fā)病率和死亡率高的重要原因[1]。 炎性反應(yīng)通常被看作是感染創(chuàng)傷因素導(dǎo)致ARDS的根本原因，是全身性炎癥反應(yīng)與代償性抗炎反應(yīng)平衡失常引起的機體破壞反應(yīng)[2]。 研究證實，巨噬細胞在ARDS發(fā)病機制中起關(guān)鍵作用[3]。

近年來， 中醫(yī)藥在ARDS的預(yù)防和治療中已被證實具有良好的潛力[4-5]。 中醫(yī)理論根據(jù)其癥狀，將ARDS歸為“喘證”“暴喘”“喘脫”等范疇[6]，治療上應(yīng)循以清熱解毒、袪瘀通腑、益氣養(yǎng)陰為主的原則[7]。 牛蒡子具有疏散風(fēng)熱、宣肺透疹、利咽散結(jié)、解毒消腫之功效，牛蒡子苷（Arctiin，Arc）是牛蒡子的主要成分，是一種苯基丙酸二芐基丁內(nèi)酯木脂素，現(xiàn)已被證實對多種疾病具有抗炎作用[8]。 本研究通過脂多糖（lipopolysaccharide，LPS） 誘導(dǎo)小鼠巨噬細胞， 建立ARDS模型，觀察Arc的抗炎作用，并進一步研究其可能的機制，以期為Arc應(yīng)用于ARDS提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 主要試劑 小鼠腹腔巨噬細胞RAW 264.7購于武漢普諾賽生命科技有限公司（編號：CL-0190）；Arc 購于北京索萊寶生物科技有限公司（批號：SA8440）； 杜爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco modified Eagle medium，DMEM） 購于美國Gibco公司（批號：C11995500BT）； 胎牛血清購于杭州四季青科技有限公司（批號：牛血清-11011-8611）；LPS、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）均購于美國西格瑪奧瑞奇集團（批號：L2880-10MG、D2650-5X5ML）；噻唑藍法（methy thiazolyl tetrazolium，MTT）細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒、 二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒（增強型）均購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司 （批號：C0009、P0010）；小鼠白介素-6（interleukin-6，IL-6）、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis-α，TNF-α） 酶 聯(lián) 免 疫 吸 附 試 驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購于杭州聯(lián)科生物有限公司（批號：70-EK206/3-96、70-EK201B/3-96、70-EK282/4-96）； 磷酸酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）、蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）、 核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、核因子-κB抑制蛋白（inhibitor of NF-κB，IкBα）兔源單克 隆 抗 體 均 購 于 美 國GST 公 司（批 號：4257、4691、8242、4812）。

1.1.2 主要儀器 DU-800紫外分光光度計購于美國Beckman公司；5415D低溫高速冷凍離心機購于德國Eppendorf公司；1658033型蛋白電泳及轉(zhuǎn)印系統(tǒng)為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 造模與分組 RAW 264.7細胞采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基， 置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 將細胞分為對照組、模型組、Arc低劑量組和高劑量組。 Arc以DMSO溶解，配成4 mg·mL-1的溶液，再加入DMEM培養(yǎng)基使Arc終濃度分別為1、4 μg·mL-1。用1、4 μg·mL-1的Arc預(yù)處理細胞24 h， 而后模型組、Arc低劑量組和Arc高劑量組以LPS刺激24 h[9]。造模方法：取10 mg LPS溶于10 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）中，加入DMEM培養(yǎng)基使LPS終濃度為0.025 μg·mL-1。

1.2.2 MTT法測定細胞存活率 取對數(shù)生長期的RAW 264.7細胞， 以5×103個/孔的細胞數(shù)量接種于96孔板，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h。 分別加入濃度為1、4 μg·mL-1的Arc，對照組不加藥。各組設(shè)置2個復(fù)孔，同時設(shè)置空白孔（僅加入100 μL PBS溶液）。 孵育24 h后，收集細胞上清液， 用于指標檢測。 向每孔加入5 mg·mL-1的MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸取上清液，最終每孔加入150 μL DMSO，水平搖床上搖動5 min，充分溶解后使用酶標儀檢測570 nm波長下各孔的光密度（optical density，OD）值。計算細胞存活率，公式如下：細胞存活率（%）=（OD給藥-OD空白）/（OD對照-OD空白）×100%。

1.2.3 共聚焦顯微鏡觀察Arc及Arc與LPS共同作用對RAW 264.7細胞形態(tài)的影響 Arc干預(yù)24 h后， 將細胞置于共聚焦顯微鏡下觀察， 用NIS-Elements f成像軟件拍照記錄細胞形態(tài)。 Arc預(yù)處理24 h后，采用LPS造模，采用同法拍攝，觀察藥物對細胞形態(tài)的影響。

1.2.4 ELISA法檢測細胞上清液中炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α表達 RAW 264.7細胞接種于96孔板，密度為5×104細胞/孔。 用1、4 μg·mL-1Arc處理細胞，然后用LPS刺激24 h。 收集上清液，ELISA檢測TNF-α、IL-1β和IL-6水平。

1.2.5 免疫印跡法檢測PI3K、AKT、p65、IкBα磷酸化水平 提取總蛋白并進行定量，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入NF-κB、IкBα一抗（稀釋比例均為1:1 000） 和PI3K、AKT一抗（稀釋比例均為1:2 000），4 ℃孵育過夜，次日以含Tween的Tris緩沖鹽溶液（Tris buffered saline with Tween，TBST） 清洗后加入二抗（稀釋比例均為1:5 000），37 ℃孵育2 h， 洗膜后滴加發(fā)光液， 置于凝膠成像系統(tǒng)顯影。 以β-actin作為內(nèi)參，采用Image J軟件分析條帶的光密度值，計算蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析。 以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Arc對RAW 264.7細胞增殖活性的影響 MTT檢測結(jié)果提示， 與對照組比較，Arc在濃度為1、4 μg·mL-1時，對RAW 264.7細胞增殖活性無明顯抑制作用（P＞0.05）。 見圖1。

圖1 各組細胞存活率比較Fig.1 Comparison of cell viability rate in each group

2.2 Arc及Arc與LPS共同作用對RAW 264.7細胞形態(tài)的影響 對照組細胞呈圓形，細胞邊緣光滑，無偽足。 Arc低劑量組和Arc高劑量組處理24 h后，細胞形態(tài)與對照組相似。 見圖2。 LPS刺激24 h后，模型組、Arc高、 低劑量組RAW 264.7細胞變長且具有偽足。見圖3。

圖2 各組細胞經(jīng)Arc處理后形態(tài)變化比較（標尺：5 μm，100PX×）Fig.2 Comparison of cell morphological changes after Arc treatment in each group（scale bar: 5 μm，100PX×）

圖3 各組細胞造模后后形態(tài)變化比較（標尺：5 μm，100PX×）Fig.3 Comparison of cell morphological changes after LPS stimulation in each group（scale bar: 5 μm，100PX×）

2.3 各組細胞上清液炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平比較 ELISA結(jié)果提示，與對照組比較，模型組、Arc各劑量組細胞上清液炎癥因子水平顯著升高（P＜0.001）。 與模型組比較，Arc各劑量組上清炎癥因子水平降低（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。 與Arc低劑量組比較，Arc高劑量組上清炎癥因子水平降低（P＜0.001）。見圖4。

圖4 各組細胞炎癥因子水平比較Fig.4 Comparison of serum levels of inflammatory cytokines in each group

2.4 各組細胞PI3K、AKT、IκBα和NF-κB磷酸化水平比較 與對照組比較，模型組細胞中PI3K、AKT、IκBα和NF-κB磷酸化水平顯著升高（P＜0.001）。 與模型組比較，Arc高劑量組PI3K、AKT和NF-κB磷酸化水平降低（P＜0.01）；Arc高劑量組IκBα磷酸化水平降低（P＜0.001）。 與Arc低 劑量 組 比較，Arc高劑量 組IκBα、NF-κB磷酸化水平降低（P＜0.05）。 見圖5。

圖5 各組細胞中PI3K、AKT、IκBα和NF-κB磷酸化水平比較Fig.5 Comparison of PI3K， AKT， IκBα and NF-κB phosphorylation levels in each group

3 討論

ARDS發(fā)展的核心， 是炎癥反應(yīng)失調(diào)和肺內(nèi)皮和上皮通透性增加， 引起彌漫性肺間質(zhì)及肺泡嚴重水腫。 最初，ARDS由失調(diào)的炎癥反應(yīng)引起，與細胞損傷相關(guān)的微生物產(chǎn)物或內(nèi)源性分子與肺上皮細胞和肺泡巨噬細胞上受體結(jié)合，激活免疫系統(tǒng)。 這個階段肺部有大量的免疫細胞浸潤， 特別是中性粒細胞和巨噬細胞，通過脫粒、釋放蛋白酶和活性氧，參與炎癥反應(yīng)[10]，如巨噬細胞合成炎癥介質(zhì)，進而引發(fā)不同程度的機體損傷。 研究顯示， 中醫(yī)藥對ARDS的治療具有良好的前景[11]。Arc是牛蒡子中提取的活性成分，有研究表明，Arc在大鼠體內(nèi)能減輕LPS導(dǎo)致的ARDS癥狀， 減少支氣管肺泡灌洗液中炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β的產(chǎn)生，發(fā)揮抗炎作用[9]。 雖然已有研究證明，Arc在大鼠體內(nèi)對ARDS具有抗炎作用， 但尚未從細胞水平探究其抗炎機制。本研究以PI3K-AKT-NF-κB信號通路為切入點， 探究Arc能否通過抑制該通路的活化從而抑制炎癥反應(yīng)。

本研究首先構(gòu)建了ARDS細胞炎癥模型， 與對照組比較， 模型組細胞上清液炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平顯著升高，表明造模成功。TNF-α是一種較為常見的炎性因子，在炎癥反應(yīng)的早期階段發(fā)揮促炎作用。 隨著炎癥的發(fā)展，它可以調(diào)節(jié)和限制機體的病理變化，并在后期起到抗炎作用[12]。 在IL-1β的驅(qū)動作用下，炎性細胞進入病變區(qū)域，這樣可提高白細胞黏附分子的表達水平，進而引起一系列炎癥反應(yīng)[13]。IL-6是一種與炎性反應(yīng)關(guān)系密切的細胞因子，研究發(fā)現(xiàn)這種因子主要來源于巨噬細胞和T細胞，通過刺激抗體的產(chǎn)生和誘導(dǎo)原始CD4+T細胞分化為效應(yīng)T細胞發(fā)揮抗炎作用[14]。 Arc預(yù)處理后，Arc高、低劑量組炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β較模型組顯著降低，Arc高劑量組細胞上清液中炎癥因子水平顯著低于Arc低劑量組。 上述結(jié)果初步證明，一定劑量的Arc能夠抑制LPS誘導(dǎo)的細胞炎癥。

ARDS本質(zhì)是肺臟的炎癥反應(yīng)。 已有研究證明，PI3K-AKT-NF-κB信號通路在肺部炎癥反應(yīng)中起重要調(diào)控作用，抑制該信號通路的激活可以抑制肺部炎癥反應(yīng)[15]。 研究證實，PI3K/AKT信號通路的活化參與了炎癥反應(yīng)，可能是通過激活NF-κB通路[16-17]。Fan等[18]用LPS攻擊小鼠內(nèi)皮細胞，建立ARDS模型，發(fā)現(xiàn)抑制NF-κB P65磷酸化和NF-κB P65核轉(zhuǎn)位，能夠減少PI3K/AKT信號通路的信號傳導(dǎo)， 從而對肺內(nèi)皮細胞發(fā)揮保護作用。Zhou等[19]建立ARDS模型，研究發(fā)現(xiàn)使用PI3K P110α抑制劑能夠發(fā)揮抗炎作用，其機制可能與PI3K/AKT信號通路有關(guān)。 本研究結(jié)果顯示，Arc各劑量組PI3K、AKT、IκBα和NF-κB磷酸化水平降低。 與Arc低劑量組比較，Arc高劑量組PI3K、AKT、IκBα和NF-κB磷酸化水平進一步降低， 表明Arc可能通過抑制PI3K-AKT-NF-κB信號通路的激活，從而發(fā)揮抗炎作用。

綜上所述，Arc對LPS誘導(dǎo)的ARDS細胞炎癥模型具有抗炎作用，其機制與抑制PI3K-AKT-NF-κB信號通路的活化有關(guān)，但本研究僅在細胞水平探討，更詳細的分子機制研究需結(jié)合體內(nèi)實驗進一步探索。

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