LINC00665通過靶向miR-708-5p/DKK3抑制食管癌細胞的增殖及侵襲

呂翠婷，尹 情，韓俊淑，董稚明，郭 煒，沈素朋，梁 佳，郭艷麗

我國食管癌的發病率和病死率均較高，90%為食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)[1]。2018年WHO公布的癌癥報告顯示，我國食管癌患者總數約占全球食管癌患者的1/2。目前我國在ESCC的診斷和治療方面雖然有了很大進展，但ESCC患者的治療效果以及遠期預后仍不理想，5年生存率不足20%[2]。近年來大量文獻報道，長鏈非編碼RNA(lncRNA)的異常表達與多種腫瘤的發生及進展密切相關[3-5]。LINC00665在乳腺癌[6-7]、前列腺癌[8]、胃癌[9]、膠質瘤[10]、結腸癌[11]、骨肉瘤[12]中均異常表達，并可通過多種機制參與腫瘤的發生、發展，但其在ESCC中的作用及機制尚未完全闡明。本實驗著重探討LINC00665在ESCC組織及細胞中的表達情況，分析其異常表達對ESCC細胞增殖、侵襲能力的影響及其發揮作用的可能分子機制，為ESCC患者的臨床靶向治療提供候選分子標志物。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2012～2015年河北醫科大學第四醫院生物樣本庫存檔的98例ESCC標本，所有患者術前均未行放、化療。每例標本均同時切取癌組織原發灶及距癌組織2～5 cm處的癌旁組織，一部分手術切除標本保存于-80 ℃低溫冰箱中，用于RNA的提取，另一部分進行石蠟包埋，行常規HE染色，經病理醫師診斷證實癌組織均為ESCC，癌旁組織均為正常黏膜組織。本實驗經河北醫科大學第四醫院倫理委員會審查通過，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 細胞株及試劑ESCC細胞株Kyse150、Kyse170、Eca109、TE13、TE1由河北醫科大學第四醫院生物樣本庫留存并傳代。Trizol總RNA提取液、Lipofectamine 2000轉染試劑和PARIS均購自美國Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒(Reverse Transcription System A3 500)、雙熒光報告基因檢測試劑盒和MTS試劑均購自美國Promega公司；RPMI-1640細胞培養基購自美國Gibco公司，Transwell小室及Matrigel膠購自美國Corning公司；miR-708-5p mimics購自中國GenePharma公司。本實驗所用引物均由上海生工公司合成。

1.3 方法

1.3.1細胞培養及轉染 Kyse150、Kyse170、Eca109、TE13和TE1細胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中，37 ℃ 5%CO2的加濕培養箱中培養。取對數生長期且細胞狀態良好的TE13細胞，常規消化并接種于6孔板中(2×105個/孔)繼續培養，待細胞生長匯合度達70%～80%時，按照Lipofectanine 2000轉染試劑說明書分別將pcDNA3.1-LINC00665、陰性對照(negative control, NC)或miR-708-5p mimics及相應陰性對照(miR-NC)進行轉染。

1.3.2qRT-PCR法檢測LINC00665及miR-708-5p的表達 按Trizol試劑說明書提取組織及細胞株中總RNA，參照Promega的逆轉錄試劑盒說明將RNA逆轉錄成cDNA，用于檢測LINC00665及miR-708-5p的表達，并以GAPDH或U6作為內參照。LINC00665引物序列：上游5′-GGTGCAAAGTGGG AAGTGTG-3′，下游5′-CGGTGGACGGATGAGAAA CG-3′。結果采用相對定量法，目的基因的相對表達量用2-△△Ct表示，其中ΔCt=Ct目的基因-Ct內參基因，ΔΔCt=ΔCt -ΔCt對照。

1.3.3MTS實驗檢測TE13細胞的增殖能力 將每毫升3×103個TE13細胞接種于96孔板中，每組設置6個復孔。分別于細胞貼壁后0、24、48、72和96 h時在每孔加入20 μL(500 μg/mL)MTS試劑，在37 ℃ 5%CO2的加濕培養箱中培養2 h。用酶標儀在490 nm波長處檢測每孔的吸光度。實驗重復3次。

1.3.4Transwell侵襲實驗檢測TE13細胞的侵襲能力 常規消化并懸浮TE13細胞于無血清培養基中，調整細胞密度接種于小室上腔(1×105個/孔)，下腔加入含10%FBS的600 μL RPMI-1640。培養24 h后，用4%多聚甲醛固定細胞，并用0.1%結晶紫染色，顯微鏡下計數5個隨機視野的細胞數。實驗重復3次。

1.3.5雙熒光素酶報告基因分析 將含有LINC00665與miR-708-5p結合位點區域片段插入熒光素酶報告基因載體pmirGLO構建pmirGLO-LINC00665報告基因質粒。同樣用含有DKK3基因3′UTR序列片段(含有miR-708-5p結合位點)構建pmirGLO-DKK3報告基因質粒。將相應質粒共轉染TE13細胞后，繼續培養48 h，收集細胞，用雙熒光素酶報告基因檢測系統測定相對熒光素酶活性。實驗重復3次。

1.3.6亞細胞定位檢測 根據PARIS試劑盒說明書，從TE13細胞中分離出細胞質和細胞核RNA，反轉為cDNA后進行qRT-PCR分析，以確定表達LINC00665的亞細胞分布情況。GAPDH為胞質表達的內參照，U6為細胞核表達的內參照。

1.3.7數據庫的應用 分別應用GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)及Starbase V3.0(https: //starb ase.sysu.edu.cn/)數據庫分析LINC00665、miR-708-5p在食管癌組織及正常組織中的表達情況；應用在線網站LncBase(http://diana.imis.athena-innovation.gr/DianaTools/index.php?r=site/page&view=software)分析可能與LINC00665結合的miRNA；應用Starbase V3.0、miRDB(http://mirdb.org/)、TargetScan 7.1(https://www.targetscan.org/vert_71/)、RNA22(https://cm.jefferson.edu/rna22/Interactive/)網站預測miR-708-5p的潛在靶基因。

2 結果

2.1 ESCC及癌旁正常組織中LINC00665的表達qRT-PCR檢測結果顯示，ESCC組織中LINC00665的表達量為3.834±2.016，明顯低于癌旁正常組織(7.973±2.752)，差異有統計學意義(t=12.011，P<0.001，圖1A)。與癌旁正常組織相比，98例ESCC組織中86例LINC00665表達下調，其中56例表達下調達50%以上(圖1B)。GEPIA數據庫分析結果同樣顯示LINC00665在食管癌組織中表達下調(圖1C)。此外，LINC00665表達與ESCC淋巴結轉移、浸潤深度及TNM分期有關(P均<0.05，表1)。

表1 LINC00665表達與食管鱗狀細胞癌臨床病理特征的關系

圖1 A.qRT-PCR法檢測食管鱗狀細胞癌及癌旁正常組織中LINC00665的表達；B.98例食管鱗狀細胞癌組織和癌旁正常組織中LINC00665表達量的比值：>1表達上調；<1表達下調；C.GEPIA數據庫分析LINC00665在食管癌組織及相應癌旁正常組織中的表達

2.2 LINC00665對ESCC細胞增殖及侵襲能力的影響qRT-PCR檢測Eca109、TE1、TE13、Kyes150、Kyse170細胞株中LINC00665的表達情況，對照組采用10例食管正常黏膜組織cDNA的等比例混合物(Pools)。結果顯示ESCC細胞株中LINC00665的表達量均低于對照組(P<0.05，圖2A)。在LINC00665表達量最低的TE13細胞中轉染LINC00665過表達質粒pcDNA3.1-LINC00665，qRT-PCR檢測轉染效率，結果顯示質粒轉染后LINC00665表達量顯著升高(P<0.001，圖2B)。分別應用MTS及Transwell小室侵襲實驗檢測LINC00665對TE13細胞增殖及侵襲能力的影響，發現過表達LINC00665可明顯降低TE13細胞的增殖(P<0.05，圖2C)及侵襲能力(P<0.05，圖2D)。

圖2 LINC00665對食管鱗狀細胞癌細胞增殖及侵襲能力的影響：A.LINC00665在Eca109、TE1、TE13、Kyes150、Kyse170細胞中的表達水平；B.qRT-PCR檢測TE13細胞中pcDNA3.1-LINC00665的轉染效率；MTS及Transwell小室侵襲實驗檢測LINC00665對TE13細胞增殖(C)及侵襲(D)能力的影響

2.3 LINC00665與miR-708-5p的相互作用研究發現lncRNA可在細胞質中通過海綿吸附miRNAs而調控miRNA靶基因的表達，即為競爭內源性RNA機制(ceRNA機制)。qRT-PCR檢測結果顯示，LINC00665主要表達于細胞質(圖3A)。在線生物信息學分析網站LncBase預測顯示，miR-708-5p與LINC00665有潛在的結合位點(圖3B)。因此，為進一步探討LINC00665通過miR-708-5p發揮ceRNA機制的可能性，依據Starbase V3.0數據庫分析162例食管癌及11例癌旁正常組織中miR-708-5p的表達情況，結果顯示食管癌組織中miR-708-5p表達明顯上調(圖3C)。同時發現轉染pcDNA3.1-LINC00665可明顯降低TE13細胞中miR-708-5p的表達水平(P<0.05，圖3D)；雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示，與miR-NC組相比，miR-708-5p mimics組能明顯降低pmirGLO-LINC00665組細胞的熒光素酶活性(P<0.05，圖3E)。表明LINC00665與miR-708-5p有結合作用。

圖3 LINC00665競爭結合miR-708-5p：A.qRT-PCR檢測LINC00665在TE13細胞中的亞細胞分布情況；B.LncBase網站預測LINC00665與miR-708-5p的結合位點；C.Starbase V3.0數據庫分析食管癌及正常組織中miR-708-5p的表達；D.qRT-PCR檢測LINC00665過表達對miR-708-5p表達的影響；E.雙熒光素酶報告基因檢測miR-708-5p過表達對報告基因熒光活性的影響

2.4 LINC00665競爭性結合miR-708-5p對DKK3基因表達的影響運用多個生物信息學數據庫(Starbase V3.0、miRDB、TargetScan 7.1和RNA22)預測miR-708-5p的潛在靶基因(圖4A)。交集后評分較高的DKK3是經典Wnt/β-catenin通路的拮抗基因。本實驗選取DKK3作為靶基因進行分析。圖4B顯示DKK3與miR-708-5p的結合位點。同時，本實驗結果顯示，轉染miR-708-5p mimics明顯降低DKK3基因的表達水平(圖4C)；雙熒光素酶報告基因結果亦顯示，miR-708-5p過表達明顯降低了含DKK3 3′UTR區結合位點片段報告基因質粒的熒光素酶活性(圖4D)。結果表明DKK3是miR-708-5p的直接靶基因。

為證實LINC00665的ceRNA機制，進一步實施了回復實驗。miR-708-5p過表達可抵消TE13細胞中由LINC00665過表達誘導的DKK3表達和報告基因熒光素酶活性的上調(圖4E、F)。上述結果表明LINC00665通過靶向miR-708-5p/DKK3軸發揮ceRNA作用。

圖4 LINC00665通過競爭性結合miR-708-5p靶向調控DKK3的表達：A.Starbase V3.0、miRDB、TargetScan 7.1和RNA22網站預測LINC00665靶基因的韋恩圖；B.TargetScan 7.1預測miR-708-5p與DKK3的結合位點；C.miR-708-5p過表達對DKK3基因表達量的影響；D.雙熒光素酶報告基因檢測miR-708-5p過表達對DKK3報告基因熒光素酶活性的影響；E、F.miR-708-5p過表達部分挽救了LINC00665過表達引起的DKK3基因表達以及基因熒光素酶活性的上調

3 討論

研究表明LINC00665在多種腫瘤中異常表達，但其發揮的功能具有腫瘤特異性，在不同腫瘤中可發揮抑癌或促癌基因作用[6-12]。本實驗發現LINC00665在ESCC組織和細胞系中的表達均下調，并且其低表達與ESCC淋巴結轉移、浸潤深度和TNM分期密切相關。功能學實驗結果顯示，LINC00665在體外抑制了TE13細胞的增殖及侵襲能力。提示LINC00665在ESCC發生、發展中可能扮演著抑癌基因作用。

文獻報道，LINC00665作為競爭性內源RNA(ceRNA)，可通過miR-379-5p/LIN28B軸、miR-1224-5p/SND1軸、miR-149-3p/RNF2軸、miR-9-5p/ATF1軸、miR-214-3p/PSMD10/ASF1B軸等分別參與乳腺癌[6]、前列腺癌[10]、胃癌[9]、結腸癌[11]、多發骨髓瘤[13]的惡性進程，提示ceRNA機制可能是該lncRNA發揮其功能的主要作用機制。lncRNAs的生物學功能依賴于其亞細胞定位，分布于細胞質中的lncRNAs能夠通過海綿吸附miRNA發揮其ceRNA功能[3]。作者通過對LINC00665的亞細胞分布檢測發現其在TE13細胞中也同樣主要定位于細胞質，于是本實驗著重從ceRNA角度探討LINC00665抑制ESCC細胞增殖、侵襲能力的可能分子機制。通過生物信息學預測，發現miR-708-5p與LINC00665有潛在的結合位點。據文獻報道，miR-708-5p的功能具有腫瘤特異性，在不同腫瘤中發揮著不同的功能。在膀胱癌[14]、結腸癌[15]中作為原癌基因促進了腫瘤的惡性進展；而在肝細胞癌[16]、卵巢癌[17]、腎細胞癌[18]中則發揮抑癌基因作用。而ESCC中miR-708-5p的作用則罕有報道，僅在Yang等[19]對113例ESCC標本進行檢測發現miR-708-5p表達明顯上調。Starbase V3.0數據庫分析結果亦顯示miR-708-5p在食管癌中表達上調。提示miR-708-5p在食管癌中可能發揮促癌基因功能。同時，研究顯示，LINC00665過表達明顯降低了TE13細胞中miR-708-5p的表達水平，結合雙熒光素酶報告基因檢測進一步證明了miR-708-5p與LINC00665的結合作用。提示LINC00665可能通過海綿吸附miR-708-5p發揮其生物學功能。

DKK3是經典Wnt/β-catenin通路的拮抗基因之一，通過結合Wnt的共受體LRP5/6使活化的受體復合物Wnt-Frizzled-LRP5/6無法形成，而特異性阻斷Wnt/β-catenin信號通路[20]。目前研究結果證明miR-708-5p直接靶向DKK3。同時，通過回復實驗及熒光素酶報告基因檢測證明LINC00665通過競爭結合miR-708-5p靶向調控DKK3的表達，即LINC00665/miR-708-5p/DKK3軸的存在亦證實了LINC00665的ceRNA功能。

本實驗結果顯示LINC00665在ESCC組織和細胞中表達下調。LINC00665過表達可抑制ESCC細胞的增殖及侵襲能力，并可通過與miR-708-5p的競爭結合靶向調控DKK3基因的表達，進而影響食管癌患者的惡性進程。