HMGB1-RAGE通路調(diào)節(jié)Treg分化在結(jié)腸癌進程中的機制分析

黃建輝，蔣 晨，王興超，錢 飛

結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率分別位居全球惡性腫瘤的第3位和第4位[1]。結(jié)腸癌的發(fā)病機制是一個復雜的過程，涉及環(huán)境影響、基因改變、宿主免疫等。文獻報道炎癥反應和免疫紊亂在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[2-5]。高遷移率族蛋白-1(HMGB1)是DAMP家族的一員，細胞外HMGB1以兩種不同的方式發(fā)揮作用：通過炎癥細胞主動分泌，或通過壞死或應激細胞作為炎癥介質(zhì)被動釋放。放療和化療會導致細胞死亡并促進HMGB1的被動釋放[6-8]。晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)可作為晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGE)的受體激活糖尿病誘發(fā)慢性炎癥[9]。研究發(fā)現(xiàn)，RAGE可導致包括HMGB1和S-100β在內(nèi)的多種分子的活化，在慢性炎癥的維持和炎癥介導的慢性疾病發(fā)展過程中扮演著至關重要的角色。RAGE對結(jié)腸癌進程中的炎癥微環(huán)境是否發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，尚無定論。鑒于此，本實驗通過人體標本和細胞實驗，探究HMGB1-RAGE通路與調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)分化的關系，初步探討HMGB1-RAGE通路在結(jié)腸癌進程中可能的免疫調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2016年1月～2020年10月南通大學附屬醫(yī)院存檔的66對結(jié)腸癌手術標本及其癌旁組織，其中男性33例，女性33例；年齡45～80歲，中位年齡60.5歲；按組織類型分為高分化腺癌16例，中分化腺癌26例，低分化腺癌24例；按國際結(jié)腸癌TNM分期標準分為Ⅰ期12例，Ⅱ期22例，Ⅲ期32例。臨床資料包括：患者性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、腫瘤生長方式等。所有入組患者無遠處轉(zhuǎn)移、術前無放療和化療史、無其它惡性腫瘤病史。

1.2 實驗試劑免疫組化SP試劑盒、辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔、鼠通用型二抗試劑盒購自DAKO Denmark生物科技公司，兔抗人RAGE多克隆抗體、鼠抗人FOXP3多克隆抗體購自Abcam公司。8周齡的SPF級Balb/C小鼠(雌、雄各半)來源于南通大學實驗動物中心。Mag Cellect Rat CD4+CD25+Treg分離試劑盒購自R&D公司。Anti-CD4(APC)、Anti-CD25(PE)和小鼠調(diào)節(jié)性T細胞流式檢測試劑盒均購自eBioscience公司。Anti-CD3和Anti-CD28購自BD公司。胎牛血清(FBS)購自Hyclone公司。RPMI-1640培養(yǎng)基購自Solarbio公司。重組人細胞因子TGF-β購自Peprotech公司。

1.3 方法

1.3.1免疫組化 標本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，脫水、包埋、切片、脫蠟至水后用EDTA抗原修復液進行高壓修復，隨后用0.3%H2O2作用10 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，再用10%胎牛血清封閉20 min，滴加一抗(稀釋比1 ∶200)并置于4 ℃冰箱過夜。第2天將切片用PBS清洗3遍后滴加二抗孵育30 min，PBS清洗3遍后滴加SP復合物反應15 min。DAB顯色后，用蘇木精復染細胞核，最后脫水，透明，封固。鏡下觀察并采集圖像進行分析。

結(jié)果判讀：免疫組化結(jié)果由兩位高年資病理醫(yī)師采用雙盲法進行閱片，隨機選取5個高倍視野，計算陽性細胞數(shù)，判定標準按照許良中等[10]的方法進行。(1)按陽性細胞百分比計分：無陽性細胞為0分；1%～33%為1分；34%～67%為2分；68%～100%為3分。(2)按陽性細胞著色強度計分：淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩項得分結(jié)果相乘作為最終評分：<2分為低表達，≥2分為高表達。

1.3.2免疫熒光 使用Pannoramic MIDI組織芯片掃描儀，通過HALO分析軟件，應用Indica Labs-HighPlex FL模塊自動識別，并設置組織切片上選定區(qū)域的綠光、紅光和共表達細胞。

1.3.3初始T細胞體外誘導iTreg 用無菌小鼠抗CD3、CD28單克隆抗體包被96孔板(用無菌PBS稀釋抗CD3和CD28抗體至終濃度CD3為10 μg/mL、CD28為4 μg/mL)，封口膜包裹96孔板4 ℃過夜，取出至37 ℃細胞培養(yǎng)箱待用，分選的初始T細胞加入RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸至每毫升1×106個，加入IL-2(300 IU/mL)和不同濃度的重組人TGF-β1(10、20、30 ng/mL)，將包被的96孔板取出后PBS沖洗3遍，每孔加200 μL細胞懸液(約2×105個細胞)，置于37 ℃ 5%CO2的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)60～108 h，用流式細胞術檢測細胞的iTreg比率。

1.3.4不同干預方式誘導iTreg效率比較 將分選初始T細胞分為2組，觀察組以TGF-β1聯(lián)合HMGB1共同刺激，對照組僅以TGF-β1刺激。利用流式細胞術分析CD4+CD25+FOXP3+Treg細胞的比例在HMGB1刺激后的改變，明確HMGB1對初始T細胞分化為iTreg細胞的影響。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌組織中RAGE、FOXP3蛋白表達及其與臨床病理特征的關系RAGE表達主要定位于癌細胞胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒，F(xiàn)OXP3在癌細胞胞質(zhì)、胞膜、胞核均有分布，主要定位于細胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒；在癌旁正常組織中，RAGE和FOXP3均僅表現(xiàn)為細胞質(zhì)中零星分散的棕黃色顆粒(圖1、2)。RAGE和FOXP3在低分化、浸潤層次深、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期晚的結(jié)腸癌組織中表達均明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(表1)。

表1 RAGE、FOXP3蛋白表達與結(jié)腸癌臨床病理特征的關系

圖1 A.結(jié)腸癌組織中RAGE陽性；B.癌旁正常組織中RAGE弱陽性，SP法 圖2 A.結(jié)腸癌組織中FOXP3陽性；B.癌旁正常組織中FOXP3陰性，SP法

2.2 RAGE和FOXP3的免疫熒光檢測免疫熒光檢測結(jié)果顯示，RAGE(紅色熒光)和FOXP3(綠色熒光)在結(jié)腸癌組織中均呈高表達，分別約占75%和60%，并且兩者有明顯的共定位，提示兩者可能存在相互作用(圖3)。

圖3 免疫熒光法分析結(jié)腸癌組織中RAGE和FOXP3的表達和定位

2.3 不同濃度TGF-β1和不同時間刺激下iTreg的轉(zhuǎn)化率利用不同濃度的TGF-β1誘導生成iTreg，結(jié)果發(fā)現(xiàn)30 ng/mL TGF-β1誘導的iTreg轉(zhuǎn)化率最高，達79.1%；在不同時間下利用TGF-β1刺激誘導iTreg，結(jié)果發(fā)現(xiàn)刺激96 h的iTreg轉(zhuǎn)化率最高，為81.2%(圖4)。

圖4 不同濃度TGF-β1和不同時間刺激下iTreg的轉(zhuǎn)化率：A.不同濃度TGF-β1誘導iTreg的轉(zhuǎn)化率；B.TGF-β1刺激不同時間誘導iTreg的轉(zhuǎn)化率

2.4 HMGB1對TGF-β1誘導的iTreg分化的影響利用TGF-β1刺激初始T細胞體外誘導96 h進行實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)觀察組iTreg的轉(zhuǎn)化率明顯高于對照組的iTreg轉(zhuǎn)化率(5.22%vs1.00%，P<0.05)，兩者差異有顯著性(圖5)。聯(lián)合HMGB1共同刺激后，TGF-β1體外誘導的iTreg轉(zhuǎn)化率增加(TGF-β1+HMGB1 9.16%vsTGF-β1 5.22%)，說明RAGE的配體HMGB1可以通過增強TGF-β1誘導iTreg的分化。

圖5 觀察組和對照組iTreg的轉(zhuǎn)化率

3 討論

RAGE蛋白是重要的炎癥因子，F(xiàn)OXP3蛋白表達賦予了T細胞免疫抑制活性，是CD4+CD25+Treg細胞重要的分子標志物，也控制著CD4+CD25+Treg的發(fā)育和功能[11-13]，在腫瘤進程中發(fā)揮免疫抑制作用。

本實驗免疫組化結(jié)果顯示，RAGE和FOXP3蛋白在低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期晚的結(jié)腸癌組織中的高表達率更高，說明兩者均與結(jié)腸癌的進展密切相關。實驗進一步對組織標本進行免疫熒光雙標檢測，發(fā)現(xiàn)RAGE和FOXP3蛋白在結(jié)腸癌組織中存在著明顯的共定位，說明兩者可能存在一定的相互作用。

本組前期實驗已發(fā)現(xiàn)：HMGB1-RAGE信號通路可以通過Ras依賴的方式激活下游Yap1轉(zhuǎn)錄因子，從而導致結(jié)直腸癌的進程[14]。因此，作者推測HMGB1-RAGE信號通路可能通過FOXP3蛋白發(fā)揮促免疫耐受作用，進而促進結(jié)腸癌的進展。

為了驗證實驗推測，課題組收集小鼠血液并利用免疫磁珠分離其中初始T細胞，以RAGE的配體重組HMGB1蛋白聯(lián)合TGF-β1刺激初始T細胞，利用流式細胞術分析CD4+CD25+FOXP3+Treg細胞的比例在HMGB1刺激后的改變，發(fā)現(xiàn)HMGB1可以明顯增強TGF-β1誘導的Treg分化。FOXP3在腫瘤中的意義已得到初步證實[15]。體外實驗證實HMGB1蛋白可以促進CD4+CD25+FOXP3+Treg細胞的增加，而CD4+CD25+FOXP3+Treg細胞的增加會導致促免疫耐受作用。本組體外實驗結(jié)果初步證實了HMGB1-RAGE通路參與Treg分化的過程，潛在發(fā)揮促免疫耐受作用。

TGF-β1通路主要是在誘導初始T細胞(naive T cells)表達Treg關鍵分子叉頭狀/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子FOXP3的過程中發(fā)揮重要作用[16]。研究發(fā)現(xiàn)，RAGE作為炎癥相關信號通路，可與TGF-β相互作用促進STAT5轉(zhuǎn)錄因子的活化，進而調(diào)控細胞的周期和增殖[17]。TGF-β1通路在HMGB1-RAGE通路和Treg分化之間可能發(fā)揮介導作用。Treg受TGF-β1和IL-2等免疫調(diào)節(jié)信號通路控制，通過提高腫瘤細胞的免疫耐受而促進腫瘤進程[18-20]。HMGB1在一些實體腫瘤中表達均升高，包括鼻咽癌、肝癌、胃癌和結(jié)直腸癌[21-24]，與本組實驗結(jié)果一致，這些腫瘤的形成需要炎癥的觸發(fā)，Treg通過與腫瘤細胞直接作用，或通過樹突狀細胞介導的腫瘤抗原遞呈和招募，Treg以誘導耐受和擊退抗腫瘤免疫反應，在腫瘤誘導耐受中發(fā)揮重要作用[25]。另有研究發(fā)現(xiàn)，細胞外的HMGB1可以通過與RAGE特異性膜受體結(jié)合，激活MAPK、NF-κB等關鍵信號通路，誘導癌細胞的生長、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移[26-27]。

本實驗通過對人體標本和體外細胞兩個層面進行研究，初步揭示了HMGB1-RAGE通路參與Treg分化的調(diào)控，潛在發(fā)揮促免疫耐受作用，進而導致結(jié)腸癌的進展。本實驗成果可能為新型抗結(jié)腸癌藥物的研發(fā)提供新靶點，然而本實驗樣本量較少，仍存在一些局限性，后續(xù)實驗將增加樣本量進行深入探究。