LDHA對乳腺癌演變的影響及SUMO化修飾

趙雪可，李 威，劉 文，黃澤翎，曹 鴿，梁偉華，曹玉文,4

有氧糖酵解途徑是腫瘤細胞包括乳腺癌特征性的代謝方式，多數腫瘤細胞通過增強糖酵解活性和產生大量乳酸及快速生成ATP促進癌細胞的生長和轉移[1-4]。乳酸脫氫酶(LDHA)是無氧糖酵解途徑中催化丙酮酸轉化為乳酸的關鍵酶。文獻報道LDHA依賴性乳酸上調加速了乳腺癌的增殖、遷移和侵襲[5-6]。Subramonian等[7]的研究表明調控LDHA表達和功能與SUMO化修飾密切相關，鼠轉移性乳腺癌中SUMO化修飾水平顯著上調。本課題組前期應用質譜技術發現人乳腺癌組織中LDHA的SUMO化修飾程度明顯降低。本文著重探討LDHA在乳腺癌變過程中的表達和臨床意義，并驗證LDHA的SUMO化修飾水平，為后續分析LDHA蛋白SUMO化修飾對乳腺癌發生、發展的影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料收集2000年1月～2010年9月石河子大學醫學院第一附屬醫院存檔的乳腺癌旁正常組織127例(距癌組織>5 cm)、普通型導管增生97例、導管不典型增生51例、導管原位癌83例、浸潤性導管癌359例。手術切除后的新鮮乳腺癌組織和癌旁正常組織各取30例，所有患者均排除術前治療及伴發嚴重疾病。患者均簽署知情同意書并經石河子大學醫學院第一附屬醫院倫理委員會審批。乳腺癌細胞MDA-MB-231和乳腺正常細胞MCF-10A購自上海復祥公司。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 石蠟切片依次二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水、高壓微波抗原修復和3%雙氧水封閉。滴加LDHA抗體(稀釋比1 ∶1 000、Abcam ab52488)孵育過夜，滴加二抗，DAB顯色，蘇木精復染。免疫組化染色采用EnVision法，由兩位資深病理醫師采用雙盲法進行判讀結果。(1)按陽性細胞百分比計分：陽性細胞數<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。(2)按染色強度計分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩項得分結果相乘：得分范圍0～12分，>4分為高表達組，≤4分為低表達組。

1.2.2Co-IP和Western blot法 乳腺癌組織和癌旁正常乳腺組織或乳腺癌細胞MDA-MB-231和乳腺正常細胞MCF-10A裂解液內加入抗SUMO1(1 ∶30、Abcam ab32058)和抗IgG(1 ∶500、Proteintech b900610)抗體，Protein A/G agarose beads捕獲抗原抗體復合物，SDS-PAGE凝膠分離，轉移至PVDF膜，滴加抗LDHA(1 ∶5 000、Abcam ab52488)及β-action抗體(北京中杉金橋公司)，然后添加二抗。Image Lab拍照并灰度掃描分析，LDHA與β-action條帶灰度比值作為LDHA相對表達量。

1.2.3在線數據庫分析LDHA mRNA表達、預測患者預后及篩選SUMO1結合位點 Oncomine(https://www.oncomine.org)和GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)數據庫分析LDHA mRNA水平。Kaplan-Meier Plotter(http:// kmPlot.com/analysis/)預測乳腺癌患者預后。GPS-SUMO(http://www.uniprot.org/)和SUMO plot Analysis Program(http://www.abgent.com/sumoplot)軟件對SUMO化位點進行篩選。

2 結果

2.1 不同乳腺組織中LDHA蛋白的表達免疫組化結果顯示，LDHA蛋白在癌旁正常乳腺組織、普通型導管增生、導管不典型增生、導管原位癌和浸潤性導管癌的上皮細胞質和細胞核出現不同程度的黃色顆粒(圖1)，陽性率分別為26.0%、26.8%、31.4%、54.2%、64.3%(表1)。癌旁正常乳腺組和普通型導管增生組中LDHA表達分別低于導管原位癌和浸潤性導管癌組，差異有顯著性(P<0.001)，導管不典型增生組中LDHA表達低于浸潤性導管癌組，差異有顯著性(P<0.001)。

圖1 乳腺癌變過程中LDHA蛋白在癌旁正常組織(A)、普通型導管增生(B)、導管不典型增生(C)、導管原位癌(D)和浸潤性導管癌(E)中的表達,EnVision法

表1 不同乳腺組織中LDHA蛋白表達[n(%)]

Western blot法檢測結果發現，乳腺癌組織和癌旁正常組織中LDHA的相對表達量分別為3.42±0.35、2.21±0.14，兩組相比差異有統計學意義(t=-5.527，P=0.005，圖2)。乳腺癌細胞和正常細胞中LDHA的相對表達量分別為1.32±0.06、0.82±0.03，兩組相比差異有統計學意義(t=-12.915，P<0.001)。

圖2 Western blot法檢測乳腺癌組織和癌旁正常乳腺組織中LDHA蛋白的表達

數據庫挖掘LDHA基因表達，通過Oncomine平臺分析389例乳腺癌組織和61例癌旁正常乳腺組織，結果顯示LDHA mRNA在乳腺癌組織中的表達量明顯高于癌旁正常乳腺組織(P<0.001，圖3)。GEPIA在線分析1 085例乳腺癌組織與291例正常乳腺組織，發現乳腺癌中LDHA mRNA水平高于正常乳腺組織，本實驗結果與之一致。

圖3 Oncomine數據庫分析乳腺癌組織和癌旁正常乳腺組織中LDHA mRNA的表達

2.2 LDHA表達與乳腺癌臨床病理特征的關系相關性分析結果顯示，LDHA蛋白表達與乳腺癌組織學高分級、淋巴結轉移、TNM III+IV期和ER陰性相關(P均<0.05，表2)。

表2 LDHA表達與乳腺癌臨床病理特征的關系

Kaplan-Meier Plotter數據庫預測結果顯示，LDHA蛋白表達與乳腺癌患者總生存期(圖4A)、無瘤生存期(圖4B)及無復發生存期呈負相關(P均<0.05)，與再次進展生存期無相關性(P>0.05)。

圖4 A.LDHA與乳腺癌患者總生存期的關系；B.LDHA與乳腺癌患者無瘤生存期的關系

2.3 LDHA蛋白SUMO化修飾Co-IP實驗中，使用SUMO1抗體IP之后，乳腺癌組織中沉淀的LDHA蛋白表達量(183 868±4 213)與正常乳腺組織(300 599±18 254)相比下降(圖5A)，表明乳腺癌組織中LDHA和SUMO1的結合水平降低。乳腺癌細胞和正常乳腺細胞中沉淀的LDHA蛋白表達量分別為242 817±24 089和186 260±9 260(圖5B)，提示乳腺癌細胞中LDHA和SUMO1的相互作用減少。

圖5 LDHA蛋白與SUMO1在乳腺癌組織(A)和細胞(B)中的相互作用：Input.陽性對照；IgG.陰性對照

網站預測LDHA與SUMO1結合的賴氨酸位點，SUMOsp2.0顯示LDHA的SUMO化修飾位點28個，SUMOplot Analysis Program預測到3個SUMO1位點，依據P<0.05且Score得分越高的原則，共同篩選出LDHA蛋白可信度最高的3個賴氨酸位點(表3)。

表3 LDHA蛋白SUMO化修飾位點

3 討論

本實驗結果顯示，LDHA蛋白從正常乳腺→浸潤性乳腺癌的癌變過程中，其表達呈逐漸升高趨勢，并且LDHA在癌旁正常乳腺組織、普通型導管增生組織中的表達分別低于導管原位癌和浸潤性導管癌，在導管不典型增生中的表達明顯低于浸潤性導管癌，與Western blot法及數據庫結果一致，這亦與文獻報道LDHA mRNA[8-9]和蛋白在乳腺癌組織和細胞中均上調的結果一致[10]，提示LDHA分子在乳腺癌變階段發揮促癌作用，推測LDHA在乳腺癌中表達增多，可能與提高LDHA酶的催化作用，從而快速產生更多能量以供癌細胞增殖的機制相關。本實驗發現，LDHA高表達與乳腺癌組織學高分級、淋巴結轉移、TNM Ⅲ+Ⅳ期和ER陰性相關，也有學者報道，LDHA表達升高的患者Ki-67表達更高、更易發生遠處轉移且分期更高[8,10-11]，說明LDHA蛋白促進乳腺癌的惡性進展。同時有文獻報道當LDHA下調時則抑制了乳腺癌的侵襲、轉移能力[9,12-13]，這與LDHA降低則減少乳腺癌細胞的乳酸生成量有關[13]，即通過干擾LDHA表達，降低了乳腺癌細胞的糖酵解從而抑制ErbB2高表達乳腺癌細胞的遷移和侵襲[13]，提示LDHA是發生淋巴結轉移和臨床晚期的重要惡性表型標志。本實驗亦發現LDHA高水平的患者其生存期明顯縮短，這與文獻報道LDHA陽性者預后較差[10-11]的結果一致，提示LDHA可能是乳腺癌新的潛在預后分子標志物。

LDHA表達和活性受到表觀遺傳學修飾的調控，SUMO化修飾是目前研究較多的一種翻譯后修飾，所謂SUMO化修飾即SUMO分子(最常見的是SUMO1)與底物蛋白特定賴氨酸殘基共價連接，調控靶蛋白表達、活性、定位、穩定性等[14]，進而影響腫瘤發生、進展[7,15]。本實驗結果顯示，正常乳腺組織和乳腺癌組織中LDHA分子與SUMO1相互結合，說明LDHA可以發生SUMO化修飾，Wen等[16]報道前列腺癌細胞中LDHA是SUMO1分子的底物蛋白。本實驗發現，正常乳腺中LDHA和SUMO1的結合水平明顯高于乳腺癌，與前期質譜結果一致，提示LDHA的SUMO化修飾可能抑制乳腺癌的發生、發展。然而，在鼠乳腺癌細胞中，LDHA的SUMO2/3修飾程度明顯低于轉移癌組[7]，與本組結果不一致。由此推測，這與LDHA結合不同的SUMO分子、在不同種屬以及乳腺癌不同階段發生的SUMO化修飾有關，需要后續實驗驗證。本實驗檢測到LDHA蛋白有3個可信度最高的SUMO化位點K284、K59和K14，提示LDHA可能通過這3個位點與SUMO1結合從而調控LDHA表達和功能。因此，需要后續實驗進一步驗證這3個位點并探討對LDHA蛋白的影響。

綜上所述，LDHA在乳腺癌變及惡性進展過程中發揮重要的促進作用，其高表達提示預后不良，并且LDHA蛋白發生SUMO化修飾。本實驗仍需進一步探討LDHA蛋白上具體賴氨酸位點發生SUMO化修飾后，對LDHA蛋白表達及乳腺癌發生、發展的影響。