冷凍切片流程中的常見問題及優(yōu)化措施

王 麗，董 巖，陳 蕓

冷凍切片技術(shù)是臨床病理學診斷中常用的一種技術(shù)方法，其主要原理是在低溫環(huán)境下使組織在較短時間內(nèi)達到適合的硬度，隨后進行快速切片、染色完成制片工作，進而于顯微鏡下觀察切片對腫瘤性質(zhì)進行判定，為臨床醫(yī)師在手術(shù)中確立手術(shù)方案提供強有力的支撐[1]。冷凍切片質(zhì)量直接影響了術(shù)中病理醫(yī)師快速診斷的速度及準確率，因此，在短時間內(nèi)完成一張優(yōu)質(zhì)的冷凍切片非常重要。該文根據(jù)2016～2021年云南省腫瘤醫(yī)院病理科使用德國徠卡CM1950恒冷冷凍切片機進行術(shù)中冷凍制片過程中的一些操作體會及常見問題進行總結(jié)及探討。

1 標本接收

當病理醫(yī)師接收到冷凍標本時，首先應(yīng)與臨床醫(yī)師核對患者的基本信息，包括患者姓名、住院科室、住院號、標本取材部位及標本名稱等，核對正確后再進行登記，避免差錯醫(yī)療事故的發(fā)生。同時，應(yīng)注意離體時間太長的標本組織細胞壞死嚴重，影響結(jié)果判定，不宜進行術(shù)中冷凍，因此行術(shù)中冷凍的標本應(yīng)盡量減少中途停留時間，盡快送檢。

2 取材

(1)取材過程中，取材醫(yī)師需要在短時間內(nèi)找到該標本正確的病變位置。一些樣本病變不明顯或腫塊較小易被遺漏，如甲狀腺微小癌，而有些標本需要廣泛取材，如乳腺導管原位癌、甲狀腺腺瘤等，因此需要取材醫(yī)師正確、快速、全面細致的取材[2]。在取材過程中，杜絕病變組織間的交叉污染，避免誤診的發(fā)生。(2)除正確取材外，送檢行術(shù)中快速冷凍切片的標本應(yīng)是新鮮的活體組織，禁止添加任何固定液，亦不能用水清洗，若表面血液或其他液體過多時可先用濾紙將其表面水分吸干后再進行取材，取材的器械需保持干燥，主要是為了防止在速凍過程中組織內(nèi)部出現(xiàn)冰晶空洞，以致組織變形，細胞增大，嚴重影響診斷結(jié)果[3]。(3)冷凍取材的大小厚度應(yīng)適宜，一般應(yīng)控制在0.2 cm×1.5 cm×1.5 cm～0.5 cm×1.5 cm×1.5 cm。太大太厚會造成組織冷凍速度減慢，產(chǎn)生冰晶。太小太薄的組織會造成切片困難，病變消失，結(jié)果不理想等問題。(4)取材完成后需和取材醫(yī)師核對病理號，保證除用于冷凍診斷的其余組織放至對應(yīng)的包埋盒中，防止標本錯放的現(xiàn)象發(fā)生。

3 切片、固定及染色

用于冷凍診斷的組織連同對應(yīng)的條碼一同放在冷凍支撐托上，進行快速冷凍，減少組織內(nèi)冰晶的產(chǎn)生。

3.1 組織的冷凍溫度選擇一般冷凍切片機的溫度以-22～-18 ℃為宜，也可根據(jù)不同的組織類型進行不同冷凍溫度的調(diào)節(jié)，云南省腫瘤醫(yī)院病理科接收到的標本主要為甲狀腺、肺、乳腺、淋巴結(jié)及子宮標本。乳腺、卵巢、肺、子宮等標本的冷凍溫度控制在-22～-18 ℃，胃、腸、闌尾等標本的冷凍溫度控制在-20～-18 ℃，甲狀腺、肝、腎、脾、淋巴結(jié)、易碎組織等標本的冷凍溫度控制在-15 ℃左右，帶少量脂肪組織控制在-25 ℃左右，含大量脂肪或全部為脂肪時，可考慮先在液氮中迅速冷凍，再放入-30 ℃左右冷凍切片機內(nèi)進行切片[4-5]。

3.2 冷凍合格的組織切片(1)采用直接切片法，組織速冷后先進行粗修，修至合適的切面進行切片，用毛筆將卷曲的組織片刷平后貼起平整的組織切片。切片的完整性對病理醫(yī)師的診斷十分重要，切片破碎不全、有缺損的原因主要有[6]：①組織脂肪或壞死組織過多；②組織塊冷凍時間太長、太硬，切片時易碎裂不成片；③組織塊邊緣帶有包膜、皮膚、組織過大或冰晶形成，難以切片；④組織過小，無法修到組織的最大切面；⑤切片刀太鈍或較臟、切片出現(xiàn)刀痕，使切片不完整；⑥切片者操作方法不正確，速度快慢不均勻，用力不平衡等使得切片不完整。(2)較小組織制作切片時，先在支撐托表面放上適當OCT進行冷凍，等OCT冷凍完成后再將組織塊放于其上進行切片，切片時應(yīng)少修，防止組織病變部位的丟失。(3)切片厚度：原則為細胞密集且體積小的組織，如淋巴結(jié)，要薄切；纖維多、細胞稀少且體積大的組織可厚切，如腦組織、脂肪組織。切片完成后組織貼好在載玻片上應(yīng)立即放入冷凍固定液中固定，固定完成后取出切片，待切片上固定液稍干燥后再放入加熱的蘇木精中進行染色。

4 染色流程

冷凍切片的染色步驟：加熱蘇木精(1～2 min)→水洗→鹽酸乙醇分化→水洗→溫水藍化→80%乙醇→醇溶性伊紅(30 s左右)→80%乙醇→90%乙醇→95%乙醇→100%乙醇→100%乙醇→100%乙醇→二甲苯Ⅰ→二甲苯Ⅱ→封片→貼標簽。

HE染色的關(guān)鍵在于深淺適度，對比明顯。染色良好的切片鏡下核質(zhì)對比清晰，藍紅相映，核膜及核染色質(zhì)顆粒清晰可見(圖1A)，HE染色對比鮮明，若細胞核及胞質(zhì)染色對比較差則增加診斷難度，使準確率降低(圖1B)。

圖1 冷凍制片鏡下觀察結(jié)果：A.染色良好；B.染色欠佳

5 冷凍制片組織的固定

待診斷醫(yī)師簽發(fā)報告后，取出冷凍組織，快速溶解OCT，再將組織放入對應(yīng)病理編號的包埋盒中(圖2)，此時應(yīng)當注意組織放入包埋盒的正反面是否正確，確保冷凍切片和石蠟HE切片為同一面，放入充足的10%中性福爾馬林中固定，如固定不及時或固定液量及濃度不足，易造成細胞蛻變，導致后續(xù)HE染色模糊不清。

圖2 術(shù)中冷凍切片標本編號

6 討論

冷凍制片技術(shù)是術(shù)中快速病理診斷的奠基石，如何在有限的時間內(nèi)快速有效地完成冷凍制片，不僅是病理診斷的需要，更是術(shù)中臨床醫(yī)師的迫切要求。對于一些腫瘤體積較小，且患者臨床無明顯癥狀及發(fā)現(xiàn)比較困難的樣本，通過術(shù)中快速冷凍病理診斷可為臨床醫(yī)師手術(shù)方式的選擇提供合理依據(jù)，從而避免對患者進行二次手術(shù)的傷害，具有一定的臨床意義。冷凍標本的取材具有一定的局限性，一些腫瘤標本體積較大，在有限時間內(nèi)無法做到完全取材，難以進行全面觀察，易造成漏、誤診。為減少及杜絕誤診的發(fā)生，在取材的過程中應(yīng)做到仔細認真核對標本，防止病變部位的丟失和污染，同時在進行冷凍切片時嚴格遵守相關(guān)操作流程及質(zhì)量控制，保障切片的質(zhì)量，在實際的操作中需做到穩(wěn)、準、快的工作效率，從而使得腫瘤病理診斷結(jié)果準確、真實、可靠。

冷凍切片質(zhì)量與常規(guī)石蠟切片質(zhì)量的差別主要是顯微鏡下組織細胞形態(tài)差別，因此影響冷凍切片的因素主要為組織取材的大小及厚度，組織冷凍切片的時間及溫度等[7]。冷凍切片的關(guān)鍵是快速冷凍，快速冷凍可減少組織內(nèi)冰晶的產(chǎn)生，一些取材較大的組織以及含水分較多的組織，常常冷凍速度過慢，易產(chǎn)生冰晶，冰晶一旦形成組織切片內(nèi)會呈現(xiàn)細胞變形、條索狀、空泡狀或細胞增大等現(xiàn)象，從而嚴重影響術(shù)中快速冷凍病理診斷的結(jié)果[8-9]。冷凍切片比一般石蠟制片要求高、難度大，因此要求病理技術(shù)員在制片的各個環(huán)節(jié)和對不同組織成分的特性有充分的認識和掌握，從標本的送檢、核對、取材、冷凍速度、切片溫度及厚度、染色等每一個環(huán)節(jié)均要認真仔細對待，只有在工作中不斷摸索、總結(jié)、改進和發(fā)現(xiàn)，才能制作出一張良好的冷凍切片。