卵巢癌SOX4介導TGF-β1誘導的上皮間質轉化對侵襲轉移能力的影響

劉 群 李麗娜 劉 健苗勁蔚

(1.首都醫科大學附屬北京安貞醫院婦產科，北京 100029；2.首都醫科大學附屬北京婦產醫院/北京婦幼保健院婦瘤科，北京 100006；3.首都醫科大學附屬北京朝陽醫院醫學研究中心，北京 100020)

卵巢癌(ovarian cancer，OC)是女性生殖系統三大惡性腫瘤之一，雖然其發生率處于婦科腫瘤的第3位，但是其病死率卻一直高居首位[1-2]。由于卵巢癌極易發生侵襲轉移，所以大部分卵巢癌患者確診時已處于晚期。雖然隨著現代醫學技術的發展，卵巢癌的診斷和治療取得了一定的進步，但是卵巢癌的預后仍不樂觀，晚期卵巢癌患者的5年生存率只有26%[1]。篩選新的介導卵巢癌侵襲轉移的關鍵分子，對于研發卵巢癌治療新策略具有非常重要的意義。

SOX4(SRY-related HMG-box4)是SOX轉錄因子家族的重要成員，與胚胎發育、腫瘤干性維持、腫瘤增殖、轉移和進展密切相關[3-5]。研究[6-10]表明，SOX4在多種癌癥中表達上調，包括黑色素瘤[6]、前列腺癌[7]、胃癌[8]、乳腺癌[9]、肝癌[10]等。上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是驅動癌癥轉移的一個重要機制[11]。已有研究[12]表明，SOX4在腎癌EMT過程中起到至關重要的作用。然而，關于SOX4在卵巢癌中的功能和機制目前尚不清楚。轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)通路是激活腫瘤EMT的一條關鍵通路[13]。本研究探討了SOX4在卵巢癌中的表達、調控及其對TGF-β1誘導EMT能力的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

DMEM高糖培養基購自美國Sigma公司；胎牛血清購自澳大利亞Ausbian公司；嘌呤霉素購自美國Gibco公司；LentiCRISPR v2來自張鋒實驗室，質粒pMD2.G和psPAX2購自美國Addgene公司；Matrigel膠購自美國BD公司；RNA提取試劑Trizol和LipofectamineTM3000試劑購自美國Invitrogen公司；反轉錄試劑盒購自北京全式金公司；qRT-PCR試劑盒購自日本Takara公司；質粒大提取試劑盒購自德國Qiagen公司；人重組TGF-β1購自美國Protech公司；所有引物合成和菌液測序均由上海生工生物有限公司完成；Western blotting所需的RIPA蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑和5×蛋白上樣緩沖液均購自上海碧云天生物技術有限公司；二喹啉甲酸 (bicinchoninic acid，BCA)試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜和辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)化學發光底物購自美國Millipore Corp公司；SOX4抗體購自美國Abcam公司，ZO1、Vimentin、Slug及GAPDH抗體均購自美國CST公司，磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS)、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔或抗鼠IgG二抗均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 細胞培養

人卵巢癌細胞SKOV3購自美國ATCC細胞庫，使用DMEM高糖培養基[含有10%(體積分數)胎牛血清]，于37 ℃和5%(體積分數) CO2的培養箱中培養。TGF-β1溶于10 mmol/L檸檬酸中，用DMEM完全培養基稀釋至10 ng/mL加入到細胞中，在培養箱中繼續培養，進行后續實驗。

1.3 細胞轉染

分別將對照Scramle-shRNA-mCherry (NC組)和shSOX4-mCherry敲除質粒(shSOX4組)按照LipofectamineTM3000轉染試劑說明書轉染進SKOV3細胞，在37 ℃培養箱中培養72 h后收集細胞提取蛋白質和RNA。SOX4的打靶序列為：AGCGACAAGATCCCTTTCATT。

1.4 Transwell實驗

取對數生長期細胞1×105個/孔，將200 μL無血清的NC組和shSOX4組細胞懸液分別接種到Transwell小室內，下室加入含有10%(體積分數)胎牛血清的完全培養基，搖勻后放入孵箱內培養24 h；取出小室，吸盡殘余培養基，用PBS清洗小室3次，再用4%(質量分數)多聚甲醛固定細胞20 min，1%(質量分數)結晶紫染色20 min，PBS清洗后，用棉簽輕輕拭去上室未遷移的細胞，置于顯微鏡下觀察拍照，在10倍視野下，隨機選取4個視野計數。侵襲實驗需預先向小室內鋪一層Matrigel膠(1∶8稀釋)，其余步驟與遷移實驗一致。

1.5 Western blotting檢測蛋白表達

待細胞狀態最佳且達到80%～90%，棄去培養基，用預冷PBS洗滌2次，用RIPA裂解液(1 mL RIPA+10 μL PMSF+10 μL蛋白酶抑制劑)提取細胞總蛋白，用試劑盒測定其濃度，95 ℃煮10 min使其變性。取60 μg總蛋白在10% (質量分數)SDS聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳，用0.2 μm的PVDF膜進行轉膜，在8% (質量分數)脫脂牛奶中封閉1 h后，用含有吐溫20的三羥甲基氨基甲烷緩沖液(Tris buffered saline with Tween 20，TBST)洗膜3次后，4 ℃搖床孵育一抗過夜。次日，用TBST洗膜3次/5 min，再用相應的二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，最后在Bio-Rad凝膠成像系統進行顯影并分析結果。

1.6 RNA提取及qRT-PCR檢測SOX4及EMT相關信號分子的表達

用Trizol提取細胞總RNA，使用全式金反轉錄試劑盒，取1 μg總RNA反轉錄成cDNA。反轉錄體系為20 μL，反應條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，-20 ℃保存。所需引物由上海生工公司設計合成，引物序列見表1，GAPDH為內參。按照qRT-PCR說明書進行反應，體系為20 μL，反應條件為95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環，用2-ΔΔCt法計算基因相對表達水平。所有反應設置3個復孔，以上所有實驗均重復3次。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 SOX4在卵巢癌中表達上調

三個卵巢癌樣本-TCGA (OV)、Bonome(GSE26712)和Hendrix (GSE6008)數據分析結果均表明SOX在卵巢癌中顯著表達上調 (P<0.000 1,P<0.000 1,P=0.006, 圖1A )。利用TCGA OV數據庫進一步分析發現，SOX4與EMT激活標志物(FN1、VIM、CTNNB1、SNAI1、SNAI2及ZEB1)呈顯著正相關(圖1B)。

圖1 SOX4在卵巢癌中的表達情況及其與EMT標志物相關性分析Fig.1 Expression of SOX4 in ovarian cancer databases and its correlation with EMT markers

2.2 SOX4敲除抑制卵巢癌細胞的EMT

利用RT-PCR和Western blotting技術檢測卵巢癌細胞SKOV3中SOX4的敲降效果，結果顯示，與對照組(NC)相比，敲降組(shSOX4)細胞中SOX4的mRNA和蛋白水平均顯著下降(圖2A、2B)。

利用Western blotting和RT-PCR檢測對EMT標志物的影響，結果顯示SOX4敲降顯著上調了上皮標志物ZO1的表達，而顯著降低了間質標志物Vimentin和Slug的表達(圖2C、2D)。

圖2 SOX4敲降對卵巢癌EMT的影響Fig.2 Effect of SOX4 knockdown on EMT of ovarian cancer

2.3 SOX4敲除抑制卵巢癌細胞的侵襲轉移能力

Transwell實驗表明，與對照細胞相比，SOX4敲降顯著下調了卵巢癌細胞的遷移能力(P<0.01, 圖3A)和侵襲能力(P<0.01，圖3B)。

圖3 SOX4敲降對卵巢癌SKOV3細胞遷移和侵襲能力的影響Fig.3 Effect of SOX4 knockdown on migration and invasion of SKOV3 cells

2.4 SOX4是TGF-β1的下游靶蛋白

TCGA數據分析卵巢癌中SOX4與TGFB1基因的mRNA表達水平顯著正相關(r=0.22，P=3×10-6，圖4A)。利用TGF-β1(10 ng/mL)處理卵巢癌SKOV3細胞，Western blotting和RT-PCR檢測結果顯示，TGF-β1處理后SOX4的mRNA水平(圖4B)和蛋白水平(圖4C)均顯著上調。

圖4 SOX4是TGF-β1的下游靶蛋白Fig.4 SOX4 is a downstream target of TGF-β1

2.5 SOX4介導TGF-β1對卵巢癌EMT的激活作用

利用TGF-β1處理對照和SOX4敲降細胞系，Western blotting檢測結果顯示，對照細胞中TGF-β1處理可以顯著下調上皮標志物ZO-1的表達，并上調間質標志物Vimentin和Slug的表達。然而，對于SOX4敲降細胞，TGF-β1處理后，上皮標志物ZO-1下調受到明顯抑制，并且間質標志物Vimentin和Slug也失去了上調的能力(圖5A)。該結果在mRNA水平通過RT-PCR技術得到了進一步驗證(圖5B)。

3 討論

腫瘤轉移是導致卵巢癌患者死亡的最主要原因，嚴重威脅全球女性生命健康[13]。近年來，針對SOX4在腫瘤中的功能與機制研究引起了廣泛關注。目前，在黑色素瘤、前列腺癌、胃癌、乳腺癌、肝癌等多種惡性腫瘤中均發現了SOX4的異常表達[6-10]，廣泛促進相關腫瘤的增殖、轉移與干細胞維持[3-5]。然而，關于SOX4在卵巢癌中的功能與機制尚無深入研究。

圖5 SOX4敲降對TGF-β1誘導卵巢癌EMT能力的影響Fig.5 Effect of SOX4 knockdown on TGF-β1-induced EMT in ovarian cancer

本研究通過檢測SOX4在多個卵巢癌樣本中的表達情況，發現SOX4在漿液性及黏液性卵巢癌中均有廣泛上調，且與卵巢癌間質標志物呈顯著正相關，提示SOX4具有調控卵巢癌EMT的潛能，該推測在卵巢癌SKOV3細胞中，通過shRNA介導的基因敲降技術得到了證實。SOX4敲降后，卵巢癌細胞上皮細胞標志物ZO-1顯著升高，而間質標志物Vimentin和Slug顯著下降。SOX4促進EMT的分子功能在腎癌和乳腺癌等多種腫瘤中也得到了證實[9,12]。

在癌癥發生發展過程中，TGF-β扮演了雙重角色。在癌癥發生的早期階段，TGF-β被認為是有效的腫瘤抑制因子，然而在癌癥發生晚期，TGF-β發揮了明顯的促轉移作用[14]。腫瘤組織中的TGF-β來源于癌細胞和腫瘤微環境中包括Treg在內的多種細胞類型，另外，成纖維細胞、巨噬細胞和血小板等也是腫瘤中TGF-β的重要產生者[14]，而TGF-β作用于腫瘤細胞可顯著激活其EMT并導致侵襲轉移的發生[15]。TCGA數據分析表明，卵巢癌中SOX4的表達水平與TGF-β1顯著正相關，提示SOX4在卵巢癌中的表達可能受TGF-β1調控。通過體外實驗，筆者充分證實SOX4是TGF-β1的下游靶蛋白，表明TGF-β1可能是卵巢癌中SOX4表達上調的一個重要因素。功能分析顯示，SOX4缺失可顯著抑制TGF-β1誘導卵巢癌EMT的能力，表明SOX4是TGF-β1誘導卵巢癌EMT的一個關鍵中間因子。而SOX4受TGF-β1的表達調控，以及SOX4在介導TGF-β1誘導腫瘤EMT中的關鍵作用，在乳腺癌[16]和胃癌[17]中也同樣得到了證實，進一步表明SOX4是TGF-β1通路促進腫瘤轉移的一個關鍵分子。

綜上，本研究充分揭示SOX4作為TGF-β1的下游靶蛋白，在卵巢癌中表達上調，并且介導了TGF-β1對卵巢癌EMT的誘導過程，表明SOX4有可能成為干預卵巢癌轉移的一個新的治療靶點。