乳腺癌中PGRMC1表達與臨床病理參數的相關性

趙 越 阮祥燕 程姣姣 谷牧青 許 新 王月姣

(首都醫科大學附屬北京婦產醫院/北京婦幼保健院內分泌科，北京 100026)

每位女性都會經歷絕經，其中大部分會出現絕經相關癥狀，這影響了中老年女性的健康并顯著降低了其生活質量。到目前為止，絕經激素治療(menopausal hormone therapy, MHT)是治療絕經相關癥狀和預防骨質疏松等最有效的方法[1-2]。然而，MHT的安全性問題，如乳腺癌，仍是困擾醫生和患者的重要問題[3]。在我國，乳腺癌是女性發病率最高的惡性腫瘤。近年來，乳腺癌發病率呈明顯上升趨勢，55～65歲為第二個發病高峰，已逐漸成為威脅女性生命健康最常見的疾病之一[4-5]。目前，全球對乳腺癌發病機制做了很多研究，而對于激素應用過程中乳腺癌風險增高的原因，則沒有定論。乳腺癌是激素依賴性腫瘤，其生長受雌激素受體、孕激素受體調控。現今普遍認為其受體表達對判斷乳腺癌患者的預后、選擇治療方案和預測療效等方面都有重要意義[6]。

本課題組在前期預實驗研究[7-10]中發現孕激素受體膜組分1(progesterone receptor membrane component 1, PGRMC1)在乳腺癌組織中高表達，很可能是乳腺癌的獨立預后因子。基于PGRMC1在乳腺癌的發生、發展中可能具有重要的作用，尤其是預測腫瘤的大小、淋巴結轉移及組織學分級等重要的與侵襲轉移和預后密切相關的指標，本研究將分析乳腺癌組織、乳腺良性腫瘤組織中PGRMC1表達的差異情況，同時分析乳腺癌患者中PGRMC1與人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2, Her-2)、細胞增殖核抗原(nuclear-associated antigen, Ki-67)及雌激素受體(estrogen receptor, ER)、孕激素受體 (progesterone receptor, PR)表達之間可能存在的聯系，為明確PGRMC1與乳腺癌惡性增殖間的相關性提供相應的臨床數據。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2017年9月至2019年1月間于首都醫科大學附屬北京婦產醫院乳腺外科就診診斷為乳腺癌的患者的乳腺癌組織標本90例，患者年齡24～70歲，年齡中位數為47歲。乳腺良性疾病標本60例，正常乳腺組織60例(來自經乳腺麥默通微創旋切良性疾病周圍1 cm左右的正常組織，病理證實乳腺組織無異常者)，60例乳腺良性疾病患者年齡26～65歲，年齡中位數為45歲，均為女性，所有組織來源者在術前經空心針活檢或經術后病理組織學檢查確診。本研究經首都醫科大學附屬北京婦產醫院倫理委員會批準(倫理批號：IEC-B-03-V01-FJ1)，所有入組參加研究者均自愿簽署知情同意書。

1)納入標準：①乳腺癌：病理診斷乳腺癌(無論有無淋巴結轉移)，無其他惡性腫瘤治療史，所有患者均未經過任何術前針對性治療，足夠可利用的組織標本。②乳腺良性疾病：乳腺纖維腺瘤，乳腺導管內乳頭狀瘤，乳腺囊性增生病。

2)排除標準：男性乳腺癌，術前接受任何形式新輔助化學藥物治療(以下簡稱化療)、靶向治療等的患者，近3個月內接受激素替代治療者。

1.2 蠟塊制備、免疫組化檢測

實驗組織取材1.0×1.0×0.5 cm3，以4%(體積分數)多聚甲醛固定1周。組織流水沖洗過夜，脫水、透明及浸蠟。石蠟包埋的病理組織塊，行4 μm厚連續切片7張，進行免疫組化及蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色。采用磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline, PBS)代替一抗作為陰性對照，用一只陽性切片作為陽性對照，實驗步驟按照試劑盒方法介紹進行。ER 1∶100、PR 1∶50、Her-2 1∶200、Ki-67 1∶300、PGRMC1 1∶100稀釋原液備用。石蠟切片脫蠟至水后進行抗原修復、內源性過氧化物酶阻斷、血清封閉、加一抗、二抗[一抗是山羊來源的用10%(體積分數)正常兔血清封閉，一抗其他來源的用3%(體積分數)牛血清白蛋白封閉]。二氨基聯苯胺(3,3’-diaminobenzidine, DAB)顯色、蘇木精復染細胞核后脫水封片。采用組織切片掃描儀及Pannoramic viewer軟件存儲切片，免疫組織化學半定量評分進行閱片[11]。

1.3 病理診斷及評估

所有患者病理診斷依據術后病理診斷結果。乳腺癌組織學類型：浸潤性導管癌80例，浸潤性小葉癌5例，導管內癌1例，乳頭狀癌3例，髓樣癌1例；病理診斷和分期按照美國癌癥聯合會(American Joint Committee on Cancer, AJCC)修訂的乳腺癌分期(第7版)標準[12]；組織學病理分級依照世界衛生組織 (World Health Organization, WHO)的標準[13]進行分級：Ⅰ級21例，Ⅱ級38例，Ⅲ級31例。乳腺良性疾病組織學類型：乳腺腺病(瘤)24例，乳腺纖維腺瘤28例，乳腺導管內乳頭狀瘤8例。

1.4 免疫組化結果的判讀和評估

將未經化療的陽性乳腺癌組織切片作為陽性對照，同時用抗體稀釋液代替一抗作為陰性對照。每張切片隨機選擇5個具有代表性的視野觀察陽性細胞著色強度，其中ER、PR、Ki-67的陽性以細胞核呈現棕黃色顆粒狀染色為主，少數為較弱的細胞質染色；PGRMC1、Her-2表達產物主要定位在細胞質和(或)細胞膜，以細胞膜/細胞質呈棕褐色或者棕黃色判定為陽性，陽性細胞數>5%為陽性(+)，≤5%為陰性(-)。蘇木精染細胞核為藍色，DAB顯出的陽性表達為棕黃色。

1.5 統計學方法

采用SPSS 19.0統計軟件對數據進行分析。組間率的比較采用χ2檢驗或者Fisher確切概率法。PGRMC1陽性表達與相關因子間的關系采用配對χ2檢驗。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 3組患者基本信息、臨床病理特征及PGRMC1表達情況比較

乳腺癌組織、乳腺良性疾病組織及正常乳腺組織患者基本信息、臨床病理特征及PGRMC1等相關蛋白表達情況，詳見表1。乳腺癌組織HE染色鏡下顯示，乳腺癌組織學Ⅰ級：癌細胞以腺樣、索狀結構為主，核仁均不明顯，核分裂罕見(圖1A)。乳腺癌組織學Ⅱ級：癌細胞以索狀和巢團狀排列為主，腺樣少見，核分裂易見(圖1B)。乳腺癌組織學Ⅲ級：癌細胞以巢團為主，細胞核多形性和分裂象均較顯著，核仁易見(圖1C)。乳腺浸潤性導管癌組織中PGRMC1的表達陽性率為63.33%(57/90)，乳腺良性疾病組織中的表達陽性率為28.33%(17/60)，正常對照組PGRMC1表達陽性率僅為6.67%(4/60)，3組間PGRMC1的表達陽性率差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 PGRMC1、ER、PR、Her-2、Ki-67蛋白表達情況及臨床基本特征Tab.1 Expression of PGRMC1, ER, PR, Her-2, Ki-67 and clinical basic characteristics n(%)

圖1 不同分級的乳腺癌組織Fig.1 Different grade of breast cancer tissue (HE staining，200×)

各組PGRMC1的免疫組織化學染色結果顯示，乳腺癌組織中細胞膜棕色深染、著色強度明顯(圖2A、2D)；乳腺良性疾病組織中細胞膜淡黃色染色，著色強度中等(圖2B、2E)；正常乳腺組織中細胞膜幾乎無染色，著色強度弱(圖2C、2F)。

圖2 PGRMC1在乳腺癌、乳腺良性疾病及正常乳腺組織的表達Fig.2 Expression of PGRMC1 in breast cancer, benign breast diseases and normal breast tissues

2.2 PGRMC1在乳腺癌中的表達與臨床病理生物學特征的關系

腫瘤直徑大、有淋巴結轉移、組織學分級高的乳腺癌患者，PGRMC1陽性表達率升高，組間比較差異有統計學意義(P<0.001)，而與患者的月經情況無關(P>0.05)，詳見表2。

表2 PGRMC1在乳腺癌中的陽性表達及與臨床病理特征的關系Tab.2 PGRMC1 expression and the correlation between PGRMC1 expression and clinicopathological features n(%)

2.3 PGRMC1與相關受體、標志物表達間的相關性

配對χ2檢驗結果顯示，乳腺癌組中的PGRMC1表達與ER、Ki-67、PR、Her-2的表達差異無統計學意義(P>0.05)，Spearman相關分析結果顯示，乳腺癌組中PGRMC1表達與ER的關系最為密切，其次是Ki-67，而與PR、Her-2表達的關系較弱,詳見表3。

表3 PGRMC1在乳腺癌中的表達及與其他指標的關系Tab.3 Correlation between PGRMC1 expression and ER, PR, Ki-67 and Her-2 expression in breast cancer

乳腺良性疾病組中，PGRMC1表達與ER、PR的表達差異有統計學意義(P<0.05)，而PGRMC1表達與Ki-67及Her-2表達的差異無統計學意義(P>0.05)，Spearman相關分析結果顯示，乳腺良性疾病組中PGRMC1表達與Ki-67(r=0.569)表達關系的密切程度大于Her-2(r=0.228)表達，詳見表4。

表4 PGRMC1在乳腺良性疾病中的表達及與其他指標的關系Tab.4 Correlation between PGRMC1 expression and ER, PR, Ki-67 and Her-2 expression in benign breast disease

3 討論

規范的絕經激素治療自20世紀始應用于臨床，現已成為全面解決絕經相關健康問題首選的臨床醫療措施。MHT是一種性激素補充治療方案，針對女性因生殖功能衰老，性激素缺乏引起的身體異常癥狀，預防心腦血管疾病、骨質疏松、早老性癡呆、改善性生活質量，是目前其他任何單一藥物不能替代的，但廣大女性在考慮MHT的風險時仍然將乳腺病變列為重中之重。我國診斷為乳腺癌的年齡為45～55歲，其中62.9%的女性被診斷為乳腺癌時還未絕經[14-15]。因此臨床需求的客觀存在使得人們不可能放棄MHT。因此多年來研究者關注MHT的焦點實際上在于其治療所帶來的一系列風險，尤其是乳腺癌的風險在最近10余年更成為研究的熱點。

隨著腫瘤分子生物學的發展，臨床上可通過腫瘤分子生物學因子在腫瘤細胞中的表達來評估腫瘤的生物學特征，從而進一步指導腫瘤的臨床治療。ER、PR、Her-2具有指導乳腺癌臨床內分泌治療和評估預后的作用[16]。PGRMC1是近年發現的新型膜激素受體，可能與激素相關腫瘤的惡性增殖及化療敏感性密切相關，尤其是作為乳腺癌發生風險的新的生物學標志物具有良好前景[17-18]。明確PGRMC1與乳腺癌惡性增殖間的相關性，這是本研究力求解決的科學問題。本實驗應用免疫組織化學法檢測了乳腺癌組織、乳腺良性疾病組織及正常乳腺組織中PGRMC1的表達情況，發現PGRMC1在乳腺癌組織中陽性率為63.33%，在乳腺良性疾病中為28.33%，在正常乳腺組織中僅為6.67%，可見PGRMC1在乳腺癌組織中呈高表達，但表達水平不一，部分強陽性表達，部分僅可見淡黃色陽性顆粒，故進一步深入探討了PGRMC1的表達與乳腺癌臨床指標的相關性。結果顯示PGRMC1的表達與乳腺癌淋巴結轉移、腫瘤大小及組織學分級間高度相關，這提示PGRMC1可能可以作為指導乳腺癌治療及預后的新指標。

本研究同時顯示在乳腺癌組織中PGRMC1的表達與ER的關系最為密切，其次是Ki-67，而與PR、Her-2表達的關系較弱，這也進一步提示：孕激素與PGRMC1結合促乳腺癌細胞惡性增殖可能與參與調控ER信號通路有關。但具體機制不明，相關機制研究仍亟待解決。

在接下來的研究中，筆者將進一步篩選出ER+乳腺癌中PGRMC1調控蛋白如Akt、IkB、Bad、c-Jun、Caspase-3等，闡明PGRMC1與ER相關信號通路的相互作用機制。同時免疫組化檢測Her-2的表達只是從蛋白水平上做一初步篩查，而聯合熒光原位雜交技術(fluorescence in situ hybridization，FISH)檢測才是檢測有無Her-2基因擴增的金標準[19]，接下來的研究中筆者將采用FISH檢測法檢測乳腺癌組織中Her-2表達情況，分析PGRMC1與經典Her-2間表達的相關性。為將來建立一套關于PGRMC1對乳腺癌風險評估的預測系統，指導臨床激素治療的安全應用奠定基礎。