134例生長受限胎兒產前診斷結果分析

侯 磊 王小新 劉麗恒 張為遠 王 欣

(首都醫科大學附屬北京婦產醫院/北京婦幼保健院產科， 北京 100026)

胎兒生長受限(fetal growth restriction，FGR)是指各類原因所導致的胎兒體質量低于同孕齡平均體質量第10百分位數或低于同孕齡平均體質量的2個標準差。國內外研究[1-2]報道FGR的發生率為3%～10%，FGR胎兒的圍產期病死率較高，不僅在孕期可能出現死胎，出生后新生兒呼吸窘迫綜合征(neonatal respiratory distress syndrome,NRDS)、低體溫、腦出血及智力障礙等遠近期并發癥發生風險也顯著增加。

FGR的病因很復雜，可以簡要歸結為母體、胎兒和胎盤三大因素，胎兒因素又稱為內因性FGR，包括染色體病、基因病、病毒感染等胎兒本身因素所導致的FGR。對于FGR胎兒的非整倍體研究已非常廣泛，以往研究[3]顯示，19%的FGR是由于染色體病導致的，約90%的18-三體、30%的21-三體胎兒有FGR表現，Yaegash等[4]報道了39.2%的Turner綜合征可伴發胎兒生長受限，Snijders等[5]的研究顯示26周前三倍體是導致FGR的最常見的染色體異常，而26周后最常見的染色體異常為18-三體。18-三體、21-三體和Turner綜合征是除了三倍體以外最常見的導致妊娠早期FGR合并胎兒畸形的非整倍體。

近年來，隨著染色體技術的不斷發展，研究[6]顯示基因拷貝數變異(copy number variations，CNVs)是基因組疾病中最常見的類型，主要的臨床特征除內臟器官畸形外，尚合并智力發育異常、精神行為改變等。國內外研究[7]顯示，對超聲異常胎兒的致病性CNV檢出率達6.0%～27.4%，有極高的臨床意義，鑒于此，母胎醫學及基因學會指南[8]建議，胎兒存在一種以上結構異常建議常規行CNVs檢測。以往的研究[9]還顯示，半數以上的病理性CNVs的孩子在胎兒期表現出生長發育遲緩，因此，對于FGR胎兒進行CNVs檢測將在很大程度上減少染色體病胎兒的出生。本文對134例FGR胎兒進行了核型聯合低覆蓋度大規模平行測序技術(copy number variation sequencing, CNV-seq)的檢測，以明確生長受限胎兒CNV的檢出率。

1 對象與方法

1.1 研究對象

將2013年1月1日至2016年12月31日間來首都醫科大學附屬北京婦產醫院產前診斷中心就診，胎兒超聲提示胎兒生長受限并知情同意接受產前診斷的134例孕婦作為研究對象，孕周18～32周，中位數孕周為25周。產前診斷的方法包括羊水穿刺102例，臍血穿刺30例，流產物送檢2例。 胎兒生長受限診斷標準依據《胎兒生長受限專家共識》[10]。孕婦術前常規遺傳咨詢并簽署知情同意書。本研究利用的研究信息不含有使受試者的身份被直接識別或通過與其相關的識別物識別的信息，屬于免除倫理審查。

1.2 資料收集

收集研究對象的一般情況、指征、血清篩查結果、遺傳室結果、超聲結果等。羊水穿刺、臍帶血穿刺及絨毛穿刺均由本院產前診斷中心完成，送檢單位為本院遺傳實驗室。羊水診斷：妊娠18～23+6周經腹羊膜腔穿刺取羊水30 mL。臍血診斷：妊娠24周后經腹臍靜脈穿刺取血2 mL。所有介入性產前診斷均在超聲定位下進行，按照常規方法進行細胞培養、收獲、制片及核型分析。

1.3 基因拷貝數變異的檢測

將50 ng基因組 DNA進行片段化處理，獲得大小為 300 bp的DNA片段，構建測序文庫[11-12]，使用 Illumina公司的HiSeq 2000平臺進行測序，36 bp單端測序，測序深度0.1倍，產生800萬條的測序序列。使用Burrows-Wheeler算法將所有測序序列與hg19基因組進行比對分析[13]。根據文獻[14]記載的數據處理和分析算法，將最少20個測試樣本進行內部比較，互相作為參考。以60 kb為基本測序單元，對大約500萬條測序序列進行分析。以標準化測序讀取密度的log2值為y軸，以相對連續的60 kb測序單元為x軸，繪制CNV-seq檢測結果圖。然后，依據每條染色體的長度計算log2平均值。

數據經查詢DGV、DECIPHER、OMIM、UCSC以及Pubmed公共數據庫資源。致病性CNV根據美國醫學遺傳學與基因組學會(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)的診斷標準，將CNVs分為3大類5級：①致病性CNVs (pathological copy number variations，pCNVs)；②良性CNVs；③臨床意義未明的CNVs；④可能致病性CNVs；⑤可能良性CNVs[15]。

1.4 統計學方法

數據采用SPSS 22.0軟件進行處理。計數資料采用頻數及率描述。計數資料組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 生長受限胎兒的染色體異常檢出情況

134例胎兒生長受限病例中總的染色體異常為13例(9.7%)，其中18-三體2例，13-三體1例，其他染色體異常1例，致病性基因拷貝數變異9例。其他染色體異常者是1例27歲孕婦，頸項透明層厚度(nuchal translucency, NT)增厚3.0 mm，絨毛穿刺CNV-seq無異常，25周表現為FGR、雙側腦積水、顱內囊腫、雙側唇裂、內臟轉位、右位心、雙腎回聲增強、左腎多囊、左足內翻行核型檢查為46，XN，der(3)t(1;3)(p26)[3]/46,XN[46]。孕婦要求終止妊娠后引產。

將胎兒生長受限病例分為孤立性胎兒生長受限(胎兒只有生長受限一項超聲異常)及綜合征性胎兒生長受限(胎兒除生長受限外尚有其他超聲軟指標或結構異常)，結果顯示孤立性生長受限胎兒的染色體異常發病率為7.3%(3/41)，綜合征性生長受限胎兒的染色體異常發病率為10.8%(10/93)，兩者差異無統計學意義(P=0.762)，詳見表1。

表1 不同類型FGR胎兒染色體異常檢出率Tab.1 Chromosome abnormities of fetus suffered from FGR

將生長受限胎兒并其他超聲軟指標及結構異常匯總后發現，胎兒生長受限最常見的伴發異常為心臟異常，兩者同時出現時染色體異常發病率為33.3%(7/21)，其次為消化系統、泌尿系統及顱內結構異常，其中，染色體異常發病率較高的是FGR伴發泌尿系統異常，染色體異常檢出率為31.3%(5/16)，不同伴發表現的生長受限胎兒染色體異常檢出率差異無統計學意義(P=0.145)，詳見表2。

表2 不同伴發表現的FGR胎兒染色體異常檢出率Tab.2 Abnormal ultrasound combined with FGR

2.2 生長受限胎兒的基因拷貝數變異檢出情況

134例標本中共檢出致病性CNV 9例，均為新發突變(表3)。3例為孤立性FGR，6例為綜合征性FGR。9例患者中，4例為Wolf-Hirschhorn綜合征(Wolf-Hirschhorn syndrome, WHS)(病例1～4)，其余有3例為已知微缺失綜合征，包括1q21.1微缺失綜合征、16p12.1微缺失綜合征、8p23.1微缺失綜合征(病例5～7)，病例8缺失片段涉及3個功能基因，病例9涉及27個功能基因，評級均為致病性。

表3 FGR胎兒病理性基因拷貝數變異Tab.3 FGR with pathogenic CNVs

標本中還檢出致病性未知病例3例。病例1，孕婦30歲，因孤立性FGR于33周行臍血穿刺，核型無異常，CNVs提示6q24.1(140960001-142020000)重復片段大小為1.06 Mb，為父源性。數據庫有3例該重復片段患者，臨床表現為整體發育遲緩；病例2，孕婦29歲，孕32周，胎兒偏小，心室強回聲，雙腎盂寬、持續右臍靜脈行臍血穿刺，顯示17p12(13220001-13620000)缺失，片段大小為0.4 Mb，數據庫中未找到相關信息，為母源性；病例3，孕婦33歲，孕23周，FGR，行羊水穿刺，顯示2q22.1(137860001-138000000)缺失片段大小為0.14 Mb，數據庫中未找到相關信息，孕婦無攜帶，父親拒絕檢測。

3 討論

以往研究[7，16-17]顯示，CNVs的檢測可以增加FGR胎兒4.8%～5.5%的染色體異常檢出率。本研究結果與以往研究結果一致，提示FGR胎兒病理性CNVs的檢出率高于核型，CNVs可增加3.7%的染色體異常檢出率，因此，在FGR的產前診斷中一定不能忽略CNVs的檢測。

本文研究還顯示，綜合征性FGR檢出率(10.8%)高于孤立性FGR(7.3%)，同以往研究一致，但差異無統計學意義，提示臨床工作中也需要重視孤立性FGR的染色體病發病風險。Shaffer等[18]應用染色體微陣列(chromosomal microarray analysis, CMA)檢測251例FGR產前標本發現，孤立性FGR為2.7%，綜合征性FGR檢出率為10.3%。Borrell等[7]對133例FGR的研究顯示，孤立性及綜合征性FGR的病理性CNVs檢出率分別是10.0%及10.5%。Brun等[19]對143例FGR的胎兒進行基因拷貝數的檢測結果顯示，病理性CNVs的檢出率達7%，均為綜合征性FGR。吳堅柱等[20]使用CMA分析了32例FGR樣本，發現孤立性FGR組、綜合征性FGR組的異常檢出率分別為14.3%和33.3%。馬玉紅等[21]的研究顯示，孤立性FGR組胎兒病理性CNVs檢出率為9.1%，綜合征性FGR組為22.7%。綜合以往研究結果，孤立性FGR檢出率為2.7%～14.3%，綜合征性FGR檢出率為10.3%～33.3%，檢出率差異較大，考慮與樣本量及病例選擇有關。

本研究顯示，孤立性FGR中的3例染色體異常均為病理性CNVs，Zhu等[22]的研究也有相似的發現，在孤立性FGR胎兒中，病理性CNVs的檢出率(33.3%)高于核型異常的檢出率(16.75%)，以上結果提示孤立性FGR更需要行CNVs的檢測。

An等[16]的研究顯示，以24周為界，將FGR分為早發型及晚發型，早發型(<24+0周) FGR的病理性CNVs檢出率為9.6%，與晚發型(24～33 周)的FGR(9.3%)差異無統計學意義。本研究中<24+0周孕婦42例，共檢出2例，檢出率4.8%，≥24周孕婦92例，共檢出11例，檢出率為12.0%，提示晚發型FGR的產前診斷也不容忽視。

目前己知的可以引起胎兒生長發育遲緩的微缺失微重復綜合征己超20多種，其中包括Williams-Beuren綜合征、WHS、22q綜合征等。以往研究[7]顯示，FGR胎兒中最常見的微缺失微重復綜合征為22q11.2重復綜合征、Xp22.3缺失綜合征及7q11.23缺失綜合征(Williams-Beuren 綜合征)，特別是在孤立性FGR胎兒中，這三類異常的總檢出率甚至超過核型異常。而本研究中，WHS檢出率最高，為4例，甚至超出非整倍體檢出率。Blanco等[23]對27例WHS患者研究分析，發現92%的WHS患兒在孕期存在胎兒生長受限。Zhen等[24]的研究顯示，6例WHS胎兒中有5例出現FGR，最早在孕21周時出現生長遲緩。WHS缺失區包含的WHSC1基因編碼位于核內的具有組蛋白甲基轉移酶活性的轉錄調節蛋白，參與早期胚胎的發育，與出生前及出生后生長發育遲緩相關。

本研究中還發現3例已知微缺失綜合征，包括1q21.1、16p12.1、8p23.1，以往的FGR研究[18]顯示，FGR所涉及的片段有4p16.3、7q11.2、12p13.3、19p13.3，分布在不同的染色體，且無明確的規律性，進一步顯示了FGR不僅與染色體結構異常或非整倍體有關，還涉及不同染色體亞顯微結構異常。通過本研究可以看出，FGR是基因拷貝數變異相關度極高的疾病，隨著數據的積累，基因拷貝數變異的檢測也為新綜合征的發現提供了堅實的基礎。