三維微環境手性特征調控間充質干細胞線粒體功能

何 穎 馮傳良 劉進營 鄭慧敏 江圣杰*

(1. 北京大學口腔醫院特診科, 北京 100034; 2.上海交通大學材料科學與工程學院, 上海 200030;3.河南大學材料學院特種功能實驗室, 鄭州 450001)

骨充填生物材料被廣泛運用在各類骨缺損修復，生物材料的多種物理性能，例如硬度、彈性、納米拓撲形貌等，能夠調節缺損區域的干細胞功能從而引導骨組織再生[1]。 手性是自然界廣泛存在的一個基本物理特性[2]，前期已有研究[3]報道了手性能夠調控間充質干細胞分化命運，同時對巨噬細胞的極化命運也有顯著的調控作用[4]，而其調控的內在機制尚不明晰。

線粒體廣泛存在于真核細胞內，其參與完成了多種細胞功能，包括三羧酸循環、能量轉換、鈣離子儲存等，其生物功能的復雜性也使得其對于間充質干細胞成骨分化起著不可或缺的作用[5]。

本實驗將通過細胞實驗聯合高通量分析和動物實驗闡明手性三維微環境介導間充質干細胞線粒體功能調控細胞命運的機制。

1 材料與方法

1.1 三維干細胞培養方法

左旋右旋三維苯丙氨酸水凝膠由上海交通大學馮傳良課題組制備。將凝膠因子粉末加入二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)溶液中，混合均勻至粉末完全溶解，制成凝膠因子DMSO 儲備液。SD大鼠骨髓間充質干細胞(RASMX-01001)與SD大鼠骨髓間充質干細胞培養基(RAXMX-90011)購置于賽業生物科技有限公司，將手性儲備液加入至細胞密度為 100萬/mL的細胞懸液中，迅速用移液槍轉移至 24 孔培養板內，每孔加入量為 500 μL。然后將 24 孔板轉移至細胞孵育箱內，待凝膠形成，再加入培養基。根據細胞的生長情況，每2 d更換新鮮培養基。該實驗于北京大學口腔醫院完成。

1.2 免疫熒光染色

使用手性水凝膠對骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)進行三維培養。在細胞接種后的第3天，使用直接法對手性基質中的 MSCs 進行線粒體的膜電位進行免疫熒光染色。染色時首先吸去 24 孔板內的培養基，用 PBS 溶液浸洗。然后分別加入使用PBS 配為1%(質量分數)BSA 溶液按相應比例稀釋后的線粒體深紅色熒光探針和線粒體綠色熒光探針染色。利用激光共聚焦顯微鏡對細胞進行觀察、拍照。

1.3 大鼠顱骨缺損模型的建立及骨再生實驗

為了驗證左旋三維微環境中細胞相關蛋白表達，使用健康的5周齡SD大鼠建立顱骨缺損模型。首先用為 1%(質量分數)戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉大鼠。待麻醉后，術區備皮，切開，剝離骨膜，使用環鉆在顱骨上打孔，使顱骨左右兩側分別形成對稱的直徑約5 mm的缺陷。將在手性水凝膠基質中培養 3 d的 MSCs(1 000萬細胞/mL)注射到新形成的大鼠顱骨缺損中，然后用不可吸收膜覆蓋以引導組織再生。每個缺損處總注射體積為100 μL?？p合。術后對大鼠使用青霉素以預防感染。在3 d后，通過吸入 CO2處死大鼠并手術分離顱骨樣本。利用組織學檢查來分析樣品。

1.4 組織切片免疫組織化學法染色

40%(質量分數)甲醛對分離出來的顱骨標本固定，EDTA搖床脫鈣14 d，包埋，切片，微波加熱免疫組化抗原修復，緩沖液洗3 min，2次，在過氧化氫阻斷劑(Abcam公司，美國，ab64218)中孵育 10 min使得免疫組化背景封閉，緩沖液洗5 min，2次，滴加非特異性背景染色處理劑，在室溫下孵育 5 min以封閉非特異性的背景染色，緩沖液洗5 min，2次。CXCL2一抗(Abcam公司，美國，ab9777)孵育2 h，緩沖液洗5 min，2次，增強子室溫孵育20 min，緩沖液洗5 min，2次，滴加酶標二抗，室溫孵育30 min，緩沖液漂洗5 min，向1 mL過氧化氫緩沖液中滴加2滴3,3-二氨基聯苯胺加強顯色液體(DAB 底物試劑盒，ThermoScientific公司，美國，34065)，混勻后滴加到切片上，孵育15 min。自來水充分沖洗、復染、脫水、透明、封片。

1.5 高通量測序與統計學方法

RNA文庫構建使用RNA文庫制備試劑盒(Illumina?公司，美國)，按照廠家的標準流程進行，樣本送至博奧晶典 (北京)公司進行測序，使用 NanoDrop 測定 RNA 濃度，凝膠電泳監測樣本RNA的完整性，完成樣本質檢后利用 oligo-dT磁珠從總RNA分離具備poly-A 尾RNA，即mRNA。 mRNA經過片段純化后，反轉錄合成 cDNA 第一鏈與第二鏈，并且對反轉錄產物末端修補為平末端，然后在3′末端加A。連接產物經過純化，去除連接不完整的產物以及空的接頭自連產物，運用與接頭序列互補的通用引物對純化樣本進行PCR 擴增。擴增產物經過純化去除引物二聚體、瓊脂糖凝膠電泳質檢以及濃度測定后，將濃度統一調整為 2 nmol/L，RNA文庫構建即告完成后上機測序。利用通路可視化軟件繪制京都基因和基因組數據庫(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)線粒體氧化代謝通路的可視化。對2 090個差異表達的基因進行富集分析，其中有146個差異基因注釋到本文中的6個基因功能條目。相關結果圖通過R軟件進行繪制。利用超幾何分布進行假設檢驗得到富集結果的P值，利用BH進行多重假設檢驗，校正P值，得到CorrectedP值，CorrectedP值越低富集結果越顯著。利用Limma包進有生物學重復或配對的差異比較，差異基因篩選標準為：|log2FC|≥1且P值≤0.05。

2 結果

2.1 線粒體膜電位檢測

在三維手性微環境中，間充質干細胞線粒體線粒體深紅色熒光探針和線粒體綠色熒光探針雙染標記分析結果顯示左旋微環境中間充質干細胞線粒體線粒體深紅色熒光與線粒體綠色熒光比例更高，并對左旋組和右旋組中20個細胞進行熒光比值定量分析，左旋組也顯著高于右旋組，表明左旋微環境中間充質干細胞線粒體膜電位穩定，而在右旋組中線粒體深紅色熒光與線粒體綠色熒光比例較低，右旋三維微環境中間充質干細胞線粒體膜電位功能受損(圖1)。

圖1 三維手性微環境中間充質干細胞線粒體膜電位染色Fig.1 Mitochondrial potential staining of mesenchymal stem cells in three-dimensional chiral microenvironment

2.2 組織學染色CXCL2趨化因子的表達

對大鼠顱骨缺損模型進行免疫組化切片染色，左旋水凝膠植入后在缺損區域促進間充質干細表達更多趨化因子CXCL2，而在右旋水凝膠植入后缺損區域CXCL2的表達明顯更低(圖2)。

2.3 KEGG線粒體膜功能可視化分析

通過對三維微環境中間充質干細胞線粒體膜氧化磷酸化功能KEGG信號通路可視化分析，對3 d樣本進行轉錄組分析，發現多種線粒體表面膜蛋白發生了顯著改變，特別是NADH相關酶活性Ndufa4出現顯著改變，佐證了三維手性微環境改變會造成干細胞內線粒體膜功能的調整從而激活下游信號(圖3)。

2.4 GO功能分析解析線粒體相關功能改變

通過對三維微環境中培養3 d的間充質干細胞轉錄組進行基因本體(gene ontology，GO)功能信號通路氣泡圖分析，發現多種線粒體功能發生了顯著改變，包括線粒體組裝、線粒體形態、線粒體降解、線粒體膜離子運輸等(圖4)。

圖2 三維手性水凝膠結合間充質干細胞體內植入組化染色Fig.2 Histochemical staining of three-dimensional chiral hydrogel combined with mesenchymal stem cells in vivo

圖3 KEGG線粒體氧化代謝通路可視化Fig.3 Visualization of KEGG mitochondrial oxidative metabolic pathway

圖4 GO線粒體相關功能分析Fig.4 GO mitochondria related function analysis

2.5 線粒體降解功能相關基因表達

通過對三維微環境中培養3 d的間充質干細胞轉錄組中多個線粒體降解相關基因進行檢測發現Ulk1、Stom、Map1、Vdec、Hlk2、Fundc2和Hsf2bp都出現了在右旋組表達上調，證明右旋微環境中間充質干細胞線粒體出現了降解(圖5)。

圖5 線粒體降解相關基因表達熱圖分析Fig.5 Heat map analysis of mitochondrial degradation related gene expression

3 討論

在生物發生過程中建立協調的組織和器官是最基本的生物學過程之一，而干細胞異質性在其中起著至關重要的作用[6]。 作為支持胚胎主要結構的重要功能器官，人體骨組織來源于位于近軸/體周中胚層的干細胞[7]。此外，這些細胞還可以分化成其他譜系，包括脂肪細胞、真皮細胞和骨骼肌細胞[8]。了解干細胞命運的異質性發育機制對于產生這些重要結構和闡明先天性疾病的病因至關重要。

手性是指兩個物質之間具備鏡像的關系例如人的左右手，結構相似，但不能夠完全疊合。手性如同硬度、彈性等是廣泛存在于自然界的一個基本物理特性，大到天體的運動，小到蛋白質和DNA結構，都具備手性特征[9]。而在生物材料領域，如何賦予材料手性這一特征，優化生物材料物理性能，提高骨缺損區植入的再生效率，仍需更深的研究討論。細胞行為與功能對細胞外環境的手性選擇與規律不僅是生命起源的重大科學問題，也啟發了再生醫學支架材料活性功能設計。

線粒體對于干細胞分化尤為重要，現有研究[10]證明不同干細胞中線粒體豐度、形態和功能存在不同的變化，并且已經確定線粒體生物發生和氧化磷酸化的代謝轉變是MSC分化的標志。除了在細胞能量代謝中發揮重要作用外，線粒體也是細胞信號傳導的關鍵介質；骨髓間充質干細胞分化需要廣泛的表觀遺傳重塑，包括通過甲基化、乙?；吞腔瘉碚{節轉錄的共價組蛋白或DNA修飾。研究[11]表明，細胞代謝的代謝中間產物需要作為表觀遺傳調節劑的輔因子，在線粒體代謝和基因表達之間提供直接聯系。然而，對于細胞外基質如何調控干細胞線粒體功能從而調控干細胞分化的直接影響知之甚少，目前已有研究證明細胞能夠識別細胞外基質信號，將環境信號傳遞到線粒體再繼續呈遞到下游[12]。

研究[13]顯示右旋三維微環境中干細胞線粒體膜電位出現了早期損傷的表現，線粒體膜電位損傷是線粒體凋亡的早期表現，當干細胞線粒體功能出現障礙后，會影響干細胞分化功能。在動物實驗中，本研究發現在左旋材料植入早期，缺損區域干細胞分泌更多的CXCL2因子，CXCL2是干細胞識別的趨化因子，其功能作用廣泛，能夠促進細胞的糖酵解活性和線粒體呼吸，由此看出在體內三維微環境中右旋微環境也不利于細胞的線粒體代謝途徑。

通過高通量測序的深入分析，本研究發現左旋三維微環境能夠顯著上調線粒體NADH脫氫酶的表達，以往研究[14-15]報道線粒體NADH脫氫酶活性抑制會造成線粒體功能損傷，這也與本研究結果相吻合。本研究中右旋微環境中NADH脫氫酶活性降低，表明右旋微環境中干細胞線粒體功能在早期已經出現障礙。本研究又對相關信號通路進行分析，結果發現手性微環境不同線粒體組裝、線粒體形態、線粒體降解、線粒體膜蛋白定位，線粒體膜鈣離子運輸，線粒體軸突轉運等功能也會出現差異，證明了手性微環境對細胞線粒體功能調控顯著。同時，在右旋微環境中線粒體降解相關基因表達上調，表明線粒體在右旋微環境中開始凋亡。

本研究的前期研究[3-4]發現，左旋微環境利于干細胞成骨分化，在本研究中找到了三維手性微環境調控干細胞命運的關鍵途徑，左旋微環境中干細胞的線粒體NADH脫氫酶表達上調，線粒體代謝功能增強，幫助了間充質干細胞向成骨方向分化，而右旋微環境中干細胞的線粒體降解凋亡增多，線粒體膜電位受損，不利于間充質干細胞的成骨方向分化。綜上所述，手性三維微環境可以調節植入干細胞的線粒體功能從而參與干細胞的分化命運，其中左旋微環境通過對細胞線粒體相關基因的調控，有利于間充質干細胞的成骨分化，對成骨有促進作用，在治療骨缺損方面具有潛在的應用價值，可以為臨床研究和應用提供依據和參考。