鐵皮石斛葉多酚提取工藝優化及其清除自由基活性

黃瓊，黃曉梅，何燕萍

（福建農業職業技術學院，福建 福州 350119）

鐵皮石斛（Dendrobium officinale）為蘭科石斛屬草本植物[1-2]。鐵皮石斛葉含有多糖、多酚、石斛堿、黃酮、萜類等生物活性物質，具有抗氧化[3]、抗炎鎮痛、調節免疫力等多種功效[4]。《中國藥典》規定鐵皮石斛以莖入藥，導致較多的葉子常被丟棄，造成鐵皮石斛資源的嚴重浪費。因此，對鐵皮石斛葉活性成分進行提取及利用可以提高鐵皮石斛資源利用率。

目前國內外對鐵皮石斛的研究多集中在鐵皮石斛多糖、總黃酮提取及利用[5-9]，而鐵皮石斛多酚的相關研究鮮見報道，張珍林等[10]研究了鐵皮石斛干花多酚的提取工藝，但關于鐵皮石斛葉多酚的研究鮮見。植物多酚因具有抗氧化、抗病毒等功效而引起人們廣泛關注[11]。植物多酚提取方法有溶劑浸提[12]、超聲波輔助提取[13]、超聲-微波協同提取[14]、超臨界CO2萃取[15]等。超聲輔助提取具有無溶劑殘留、提取能力強、易操作、能耗低等優點，目前被廣泛應用于天然產物的提取。本試驗對鐵皮石斛葉多酚超聲輔助提取的最優工藝條件和鐵皮石斛葉多酚清除自由基活性進行研究，旨在擴大鐵皮石斛產品附加值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鐵皮石斛葉：福建南靖鐵皮石斛人工大棚種植基地；沒食子酸（純度≥98%）：天津市科密歐化學試劑有限公司；福林酚試劑（分析純）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；抗壞血酸（純度≥99%）：南京建成生物工程研究所；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼 （1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（純度為 96%）：上海銘博生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

KQ5200DE超聲清洗儀：昆山市超聲儀器有限公司；UV-1800-DS2紫外可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；LGR10-4.2高速冷凍離心機：上海安亭科學儀器廠；RE-52AA旋轉蒸發器：上海亞榮生化儀器設備公司；FD-2C-80真空冷凍干燥機：上海繼譜電子科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 鐵皮石斛葉多酚提取工藝流程

鐵皮石斛葉→60℃烘干→粉碎過篩→樣品粉末→超聲輔助提取→離心→取上清液→濃縮→干燥→多酚樣品。

1.3.2 鐵皮石斛葉多酚提取量計算

鐵皮石斛葉多酚含量測定采用福林酚法[16]，鐵皮石斛葉多酚提取量計算參考文獻[17]。

1.3.3 單因素試驗

1.3.3.1 乙醇體積分數對鐵皮石斛葉多酚提取量的影響

固定超聲功率為200 W，提取溫度為40℃，提取時間為 20 min，液料比為 10∶1（mL/g），提取 1 次，考察乙醇體積分數（0%、15%、30%、45%、60%、75%）對鐵皮石斛葉多酚提取量的影響。

1.3.3.2 超聲功率對鐵皮石斛葉多酚提取量的影響

固定乙醇體積分數為45%，提取溫度為40℃，提取時間為 20 min，液料比為 10∶1（mL/g），提取 1 次。考察超聲功率（200、250、300、350、400、450 W）對鐵皮石斛葉多酚提取量的影響。

1.3.3.3 提取時間對鐵皮石斛葉多酚提取量的影響

固定乙醇體積分數為45%，超聲功率為350 W，提取溫度為40℃，液料比為10∶1（mL/g），提取1次。考察提取時間（20、25、30、35、40、45 min）對鐵皮石斛葉多酚提取量的影響。

1.3.3.4 液料比對鐵皮石斛葉多酚提取量的影響

固定乙醇體積分數為45%，超聲功率為350 W，提取溫度為40℃，提取時間為30 min，提取1次。考察液料比[10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1（mL/g）]對鐵皮石斛葉多酚提取量的影響。

1.3.3.5 提取溫度對鐵皮石斛葉多酚提取量的影響

固定乙醇體積分數為45%，超聲功率為350 W，提取時間為 35 min，液料比為 40∶1（mL/g），提取 1 次。考察提取溫度（40、50、60、70、80、90 ℃）對鐵皮石斛葉多酚提取量的影響。

1.3.4 響應面優化試驗

以鐵皮石斛葉多酚提取量作為試驗設計的響應值，由單因素顯著性分析得到對響應值影響較大的4個因素，采用四因素三水平的試驗設計確定最優鐵皮石斛葉多酚提取工藝條件。試驗因素與水平設計見表1。

表1 響應面試驗因素水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.3.5 鐵皮石斛葉多酚清除自由基試驗

以VC為對照，參考文獻[18]測定鐵皮石斛葉多酚對羥自由基的清除作用，參考文獻[19]測定鐵皮石斛葉多酚對超氧陰離子自由基的清除作用，參考文獻[20]測定鐵皮石斛葉多酚對DPPH自由基的清除作用。

1.4 數據分析

利用SPSS 21.0對單因素試驗結果進行顯著性分析，利用Design Expert 8.0.6軟件進行響應面試驗設計。試驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇體積分數對鐵皮石斛葉多酚提取量的影響

乙醇體積分數對鐵皮石斛葉多酚提取量的影響見圖1。

圖1 乙醇體積分數對鐵皮石斛葉多酚提取量的影響Fig.1 Effects of ethanol volume fraction on extaction amount of polyphenols from Dendrobium officinale leaves

由圖1可得，多酚提取量隨著乙醇體積分數增大呈現先增大后減小的趨勢，當乙醇體積分數為45%時，多酚提取量最大。原因是乙醇有利于含有羥基的多酚溶解析出，但是乙醇體積分數太大，多酚受醇溶性雜質影響，抑制溶出。因此，乙醇體積分數以45%為宜。

2.1.2 超聲功率對鐵皮石斛葉多酚提取量的影響

超聲功率對鐵皮石斛葉多酚提取量的影響見圖2。

圖2 超聲功率對鐵皮石斛葉多酚提取量的影響Fig.2 Effects of ultrasonic power on extaction amount of polyphenols from Dendrobium officinale leaves

由圖2可得，多酚提取量隨著超聲功率增大先增大后減少，超聲功率為350 W時，多酚提取量最大。原因是超聲功率增加，萃取溫度升高，細胞組織被分解得更徹底，增大多酚提取量；但超聲功率過高，導致萃取溫度過高，多酚被氧化分解，降低多酚提取量。因此，超聲功率以350 W為宜。

2.1.3 提取時間對鐵皮石斛葉多酚提取量的影響

提取時間對鐵皮石斛葉多酚提取量的影響見圖3。

圖3 提取時間對鐵皮石斛葉多酚提取量的影響Fig.3 Effects of extraction time on extaction amount of polyphenols from Dendrobium officinale leaves

由圖3可得，多酚提取量隨著提取時間延長先增大后減小，提取時間為35 min時，多酚提取量最大。原因是延長提取時間，鐵皮石斛葉與溶劑接觸時間越長，多酚越能充分地從鐵皮石斛葉擴散到溶液中，但是提取時間過長，多酚易被氧化破壞，導致多酚提取量下降。因此，提取時間以35 min為宜。

2.1.4 液料比對鐵皮石斛葉多酚提取量的影響

液料比對鐵皮石斛葉多酚提取量的影響見圖4。

圖4 液料比對鐵皮石斛葉多酚提取量的影響Fig.4 Effects of liquid-solid ratio on extaction amount of polyphenols from Dendrobium officinale leaves

由圖4可得，多酚提取量隨著液料比增大先增大后減小，液料比為40∶1（mL/g）時，多酚提取量最大。原因是提取溶劑體積越大，接觸面積也越大，多酚提取量越高，但是提取溶劑體積過大，多糖、蛋白質等雜質溶解析出，多酚提取量降低，也不利于后續多酚的提純。因此，液料比以 40∶1（mL/g）為宜。

2.1.5 提取溫度對鐵皮石斛葉多酚提取量的影響

提取溫度對鐵皮石斛葉多酚提取量的影響見圖5。

圖5 提取溫度對鐵皮石斛葉多酚提取量的影響Fig.5 Effects of extraction temperature on extaction amount of polyphenols from Dendrobium officinale leaves

由圖5可得，多酚提取量隨著提取溫度升高先增大后減少，提取溫度為60℃時，多酚提取量最大。原因是提取溫度越高，有機溶劑擴散和傳播得越快，越有利于多酚提取，但溫度太高，易造成多酚分解。因此，提取溫度以60℃為宜。

2.2 各單因素與鐵皮石斛葉多酚提取量的方差分析

對5個單因素進行方差分析，結果如表2所示。

表2 單因素試驗方差分析結果Table 2 Variance analysis on single-factor experiment

由表2可知，乙醇體積分數、超聲功率和液料比對多酚提取量均有極顯著影響（P＜0.01），提取時間對多酚提取量影響顯著（0.01＜P＜0.05），提取溫度對多酚提取量影響不顯著（P＞0.05）。因此，選擇影響多酚提取量的關鍵因素（乙醇體積分數、超聲功率、提取時間和液料比）進行響應面試驗。

2.3 響應面試驗

2.3.1 響應面試驗設計與結果

響應面試驗設計及方差分析見表3～表4。

表3 Box-Behnken設計方案及試驗結果Table 3 Box-Behnken design and results

續表3 Box-Behnken設計方案及試驗結果Continue table 3 Box-Behnken design and results

表4 回歸方程的方差分析Table 4 Analysis of variance of the regression equation

對表3數據進行二次多項式回歸模型方程擬合，得到鐵皮石斛葉多酚提取量（Y）對乙醇體積分數（A）、超聲功率（B）、提取時間（C）、液料比（D）的回歸方程：Y=32.60+0.72A+0.22B+0.34C-0.20D-0.087AB-0.35AC+0.28AD+0.083BC-0.14BD-0.022CD-0.47A2-0.076B2-0.30C2-0.32D2。（R2=0.982 6），說明實測值與預測值之間有很高的相關性。由表4可知，模型中的失擬項（P＞0.05）表明此模型擬合度良好。A、B、C、D、AC、AD、BD、A2、C2和 D2對多酚提取量的影響極顯著（P＜0.01），B2對多酚提取量的影響顯著（P＜0.05）。影響多酚提取量主次順序：乙醇體積分數（A）>超聲功率（C）>液料比（B）>提取時間（D）。

2.3.2 響應面分析因素間的相互作用

各因素交互作用對鐵皮石斛葉多酚提取量影響結果見圖6。

圖6 不同因素對鐵皮石斛葉多酚提取量影響的響應面圖Fig.6 Response surface map of the effect of different factors on the extraction of polyphenols from Dendrobium officinale leaves

由圖6可得，各響應面均具有最高點，表明在所選的范圍內多酚提取量均具有最大值。響應曲面越陡峭，表明該因素對多酚提取量的影響越顯著。由圖6響應曲面得，4個因素對多酚提取量的影響均顯著，這與表5方差分析的結果一致。

2.3.3 響應面試驗模型的驗證

根據模型獲得4個變量的最優值，乙醇體積分數50.55%，超聲功率350 W，提取時間37.47 min，液料比36.02∶1（mL/g），在最優提取工藝條件下，鐵皮石斛葉多酚提取量理論值為33.03 mg/g。為了進一步檢驗試驗方法的可靠性，考慮實際操作簡便，調整最優提取工藝條件為乙醇體積分數50%，超聲功率350 W，提取時間 37 min，液料比 36∶1（mL/g）。結果表明試驗值（32.87 mg/g）與理論預測值（33.03 mg/g）相對誤差為0.48%，差異不顯著（P>0.05）。因此，利用響應面優化鐵皮石斛葉多酚提取工藝條件結果可信。

2.4 提取次數對鐵皮石斛葉多酚提取量的影響

按鐵皮石斛葉多酚最優提取工藝條件即乙醇體積分數50%，超聲功率350 W，提取時間37 min，液料比 36∶1（mL/g），提取溫度 60℃，分別提取 1、2、3次，結果見圖7。

圖7 提取次數對鐵皮石斛葉多酚提取量的影響Fig.7 Effects of extraction times on extaction amount of polyphenols from Dendrobium officinale leaves

由圖7可知，提取2次，鐵皮石斛葉多酚提取量最大，說明提取2次已基本提取完全，若增加提取次數不但多酚提取量降低，還會導致其他成分溶出，不利后續提純。因此，提取以2次為宜，鐵皮石斛葉多酚提取量為34.15 mg/g。

2.5 鐵皮石斛葉多酚清除自由基能力

2.5.1 鐵皮石斛葉多酚對羥自由基的清除能力

鐵皮石斛葉多酚對羥自由基的清除能力結果見圖8。

圖8 不同濃度鐵皮石斛葉多酚和VC對羥自由基的清除率的影響Fig.8 Effects of different concentrations of Dendrobium officinale leaf polyphenols and VCon the scavenging rate of hydroxyl radicals

由圖8可知，鐵皮石斛葉多酚和VC對羥自由基清除率均隨著質量濃度增大而升高。鐵皮石斛葉多酚和VC對羥自由基清除率IC50值分別為 0.554 mg/mL和0.325 mg/mL，說明鐵皮石斛葉多酚清除羥自由基能力弱于VC。

2.5.2 鐵皮石斛葉多酚對超氧陰離子自由基的清除能力

鐵皮石斛葉多酚對超氧陰離子自由基的清除能力結果見圖9。

圖9 不同濃度鐵皮石斛葉多酚和VC對超氧陰離子自由基的清除率的影響Fig.9 Effects of different concentrations of Dendrobium officinale leaf polyphenols and VCon the scavenging rate of superoxide anion free radicals

由圖9可知，鐵皮石斛葉多酚和VC對超氧陰離子自由基清除率均隨著質量濃度的增大而升高。鐵皮石斛葉多酚和VC對超氧陰離子自由基清除率IC50值分別為0.775 mg/mL和0.364 mg/mL，說明鐵皮石斛葉多酚清除超氧陰離子自由基能力弱于VC。

2.5.3 鐵皮石斛葉多酚對DPPH自由基的清除能力

鐵皮石斛葉多酚對DPPH自由基的清除能力結果見圖10。

圖10 不同濃度鐵皮石斛葉多酚和VC對DPPH自由基的清除率的影響Fig.10 Effects of different concentrations of Dendrobium officinale leaf polyphenols and VCon the scavenging rate of DPPH free radicals

由圖10可知，鐵皮石斛葉多酚和VC對DPPH自由基清除率均隨著質量濃度的增大而升高。鐵皮石斛葉多酚和VC對DPPH自由基清除率 IC50分別為0.596 mg/mL和0.358 mg/mL，說明鐵皮石斛葉多酚清除DPPH自由基能力弱于VC。

3 結論

本試驗以鐵皮石斛葉為原料，通過單因素和響應面試驗優化，得到各因素對鐵皮石斛葉多酚提取量影響主次順序：乙醇體積分數＞超聲功率＞料液比＞提取時間。超聲輔助提取鐵皮石斛葉多酚的最優工藝條件：乙醇體積分數50%，超聲功率350 W，提取時間37 min，液料比 36∶1（mL/g），提取溫度 60 ℃，提取 2 次，在此條件下，鐵皮石斛葉多酚提取量為34.15 mg/g，說明利用超聲輔助提取鐵皮石斛葉多酚具有實際應用價值。以同濃度梯度的VC作對照，清除自由基試驗結果表明，鐵皮石斛葉多酚能夠有效清除羥自由基、超氧陰離子自由基及DPPH自由基，且清除能力隨著多酚質量濃度增加而增強，表明鐵皮石斛葉多酚具有較強的抗氧化活性，根據IC50值的比較可知鐵皮石斛葉多酚的清除自由基效果均弱于同濃度梯度的VC。