綠豆芽菜制作工藝優化及營養功能成分分析

王可心，楊思敏，林瑞嫦，劉蓓蓓，高玉萌，李鑫，高小麗

（西北農林科技大學農學院，陜西 咸陽 712100）

發芽無需復雜的設備、生產周期快、在生產中占用的空間很小，因此是一種簡單且成本低廉的加工過程[1-2]，同時芽菜的產量較高[3]而受到人們的喜愛。綠豆芽菜因其營養價值大于綠豆籽粒，口感脆嫩，在中國芽菜消費中占比最大。Mbithi等[4]和Gan等[5]研究表明，發芽后綠豆籽粒中的營養物質含量和藥用價值得到提高，一方面綠豆籽粒萌發后原本存在于其體內的胰蛋白酶被激活由結合態轉化為游離態，單寧含量下降，植酸等抗營養因子減少，另一方面綠豆籽粒發芽后碳水化合物、蛋白質、脂肪酸等主要常量營養成分分解代謝為單糖、游離氨基酸和有機酸，更易于被人體吸收，營養價值大大提高[6]。此外，萌發過程中維生素 A、維生素 B17、維生素 C 及 γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）含量增加，常吃綠豆芽菜能有效預防心血管疾病、直腸癌和與年齡相關的功能衰退等慢性疾病的發生[7-9]。

近年來，中國芽菜產業發展迅速，芽菜的家庭小作坊式生產逐漸轉變為工業化大規模生產。生物和非生物誘導因子進行調節可以強化發芽過程中營養成分及其他生物活性物質的改變，但是隨著食品安全越來越受到重視，人們對芽苗菜的品質提出了更高的要求，低加工和無添加劑成為芽苗菜研究熱點[10-11]。

工業化豆芽培育一般包括燙種、浸種、控溫和噴淋等程序，不同的工序對豆芽的產量及品質有不同程度的影響，從而關系到豆芽生產的經濟效益[12-14]。目前，系統研究非生物因素的改變對豆芽產量及品質的影響較少。浸泡時間、發芽溫度及淋噴間隔作為綠豆芽菜制作工藝中必不可少的考慮因素，優化出最佳發芽條件對綠豆芽菜的生產具有重要意義。目前，我國綠豆種皮的顏色主要包括綠色和黑色，但卻沒有對不同顏色綠豆發芽條件的研究。因此，本研究以豆芽產量最大化為目的，通過單因素試驗結合響應面分析，以芽豆比為響應值，對不同品種綠豆浸泡時間、發芽溫度及淋噴間隔進行優化。在優化條件的基礎上，研究不同粒色綠豆萌發過程中養分物質及抗氧化活性物質的變化特征，旨在為高產優質綠豆芽菜的生產及其開發利用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

綠豐2號綠豆（綠色種皮）、保綠200520-2（黑色種皮）：西北農林科技大學小宗糧豆課題組提供。

蒽酮、3，5-二硝基水楊酸：國藥集團化學試劑有限公司；濃硫酸、氫氧化鈉、丙酮：洛陽昊華化學試劑有限公司；硫酸銅、硫酸鉀：廣東省化學試劑工程技術研究開發中心；植物類黃酮含量檢測試劑盒、植物總酚含量檢測試劑盒、DPPH自由基清除能力檢測試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；葡萄糖、牛血清白蛋白、考馬斯亮藍G-250、無水乙醇、沒食子酸：成都科隆化學品有限公司；以上化學試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器與設備

FW-100D高速萬能粉碎機：天津鑫博得儀器有限公司；TDL-5A離心機：上海菲恰爾分析儀器有限公司；Bluestar B紫外可見分光光度計：北京萊伯泰科儀器股份有限公司；DK-S26電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設備有限公司；KQ-500DE型數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；XW-80A旋渦混合儀：海門市其林貝爾制造有限公司；K9860全自動凱氏定氮儀：濟南海能科學儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 綠豆發芽基本條件

挑選色澤光亮、飽滿未破損的籽粒，用75%的酒精消毒5 min，將酒精瀝干后將籽粒轉移至蒸餾水清洗3次，然后在 25℃、黑暗條件下用蒸餾水（1∶10 g/mL）浸泡9 h。將含水的種子單層平鋪在覆有紗布的托盤上。托盤置于發芽機中，黑暗培養，平均溫度為24℃。每8h用蒸餾水清洗一次豆芽。每個品種發芽3份。培養96 h后收獲綠豆芽菜，進行綠豆芽菜的芽豆比測定，芽豆比=綠豆籽粒質量（g）/豆芽質量（g）。

1.2.2 單因素試驗

1.2.2.1 浸泡時間對豆芽芽豆比的影響

以發芽平均溫度24℃，淋噴間隔8 h，浸泡0、3、6、9、12 h為發芽條件在發芽機內發芽，使種子保持濕潤狀態，發芽至96 h取出，考察浸泡時間對芽豆比的影響。

1.2.2.2 發芽溫度對豆芽芽豆比的影響

以浸泡時間9 h，淋噴間隔8 h，平均溫度20、22、24、26、28℃為發芽條件在發芽機內發芽，使種子保持濕潤狀態，發芽至96 h取出，考察發芽溫度對芽豆比的影響。

1.2.2.3 淋噴間隔對豆芽芽豆比的影響

以浸泡時間9 h，平均溫度24℃，淋噴間隔2、4、6、8、10 h為發芽條件在發芽機內發芽，使種子保持濕潤狀態，發芽至96 h取出，考察淋噴間隔對芽豆比的影響。

1.2.3 響應面試驗設計

在單因素試驗的基礎上，選擇發芽溫度、浸泡時間和淋噴間隔為自變量，以芽豆比為響應值，根據Box-Behnken設計原理，采用三因素三水平響應面分析法進行試驗設計，優化綠豆發芽條件。響應面優化試驗因素水平見表1。

表1 響應面優化試驗因素水平Table 1 Factors and levels of response surface optimization test design

1.3 營養品質和功能成分指標測定

在優化的最佳條件下發芽，每個品種發芽3份，每隔24 h取樣一次，直到綠豆芽菜形成的96 h，去根去皮后烘干磨粉，過80目篩，置于-20℃冰箱待測。

淀粉含量：采用蒽酮比色法[15]進行測定；可溶性糖含量：采用蒽酮比色法[15]進行測定；蛋白質含量：參考GB 5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》[16]；可溶性蛋白含量：采用考馬斯亮藍法[15]；DPPH自由基清除率測定、總酚含量測定、總黃酮含量測定：均采用試劑盒測定。

總酚、總黃酮及DPPH自由基提取液的制備：在離心管中加入0.5 g脫脂后的樣品，加入5 mL 70%丙酮，將混合物150 r/min振蕩搖動3 h后，以4 000 r/min將提取物離心分離10 min，并將上清液移至10 mL離心管。將殘余物進行第二次萃取。將兩次提取物合并，并在-4℃下儲存。每個處理3次重復。

1.4 數據處理

每組試驗均重復3次，數據統計分析采用Design-Expert 8.0.6.1和SPSS 22.0軟件，P＜0.05有統計學意義，origin 2021作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 浸泡時間對芽豆比的影響

浸泡時間對芽豆比的影響見圖1。

圖1 浸泡時間對芽豆比的影響Fig.1 Effect of soaking time on sprout bean ratio

如圖1所示，隨浸泡時間的延長，不同粒色綠豆發芽后的芽豆比均呈現先升高后降低的趨勢，其中黑皮綠豆浸泡6 h芽豆比最高，綠皮綠豆浸泡9 h芽豆比最高。其原因可能為，綠豆萌發前期進行浸泡處理的時間長短直接影響綠豆芽菜的產量及品質，通過浸種處理可以軟化細胞壁、增強種皮通透性、解除籽粒休眠，同時還可以減少綠豆所含的單寧含量，降低胰蛋白酶抑制劑活性[17-18]。浸泡時間較短則達不到軟化種皮的目的，胚軸很難突破種皮伸長導致芽豆比下降，但浸泡時間過長則會導致綠豆籽粒中的營養成分過度流失。因此，浸泡時間選擇9 h較為合適。

2.1.2 發芽溫度對芽豆比的影響

發芽溫度對芽豆比的影響見圖2。

圖2 發芽溫度對芽豆比的影響Fig.2 Effect of germination temperature on sprout bean ratio

如圖2所示，黑皮綠豆的芽豆比隨發芽溫度的上升呈現上升-下降-上升的趨勢，綠皮綠豆呈現先上升后下降的趨勢，整體而言發芽溫度為24℃～28℃芽豆比得到了明顯的提升。隨著發芽溫度的升高，芽體內的酶活力增加，呼吸作用加強，物質分解、轉換和運輸速率加快，有利于芽體細胞的伸長和擴大，使豆芽生長迅速[19]。在20℃～22℃時芽豆比增長緩慢，可能是由于溫度相對較低限制了酶的活性，細胞分裂和生長的速度緩慢。因此，發芽溫度選擇26℃左右。

2.1.3 淋噴間隔對芽豆比的影響

淋噴間隔對芽豆比的影響見圖3。

圖3 淋噴間隔對芽豆比的影響Fig.3 Effect of spraying interval on sprout bean ratio

如圖3所示，兩個品種的綠豆芽豆比均在每6 h淋噴一次時獲得最大芽豆比。淋噴間隔過長則導致產量下降，究其原因為豆芽需水量得不到滿足，從而延緩物質轉運速率，限制豆芽的生長；淋噴間隔時間短，供水充足導致氧氣濃度過低，豆芽中激素類物質的活性受到抑制，水溶性物質流失過多，營養品質下降，限制豆芽的生長。因此，淋噴間隔選擇4 h～8 h較為合適。

2.2 響應面試驗結果與分析

2.2.1 響應面試驗設計與結果

根據單因素試驗結果，選擇發芽溫度、浸泡時間和淋噴間隔3個因素和水平，采用三因素三水平響應面優化試驗，其設計和結果見表2。

表2 Box-Behnken試驗設計與結果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

2.2.2 響應面回歸方程的建立及檢驗

運用Design-Expert 8.0.6.1軟件對表2的試驗結果進行二元多項回歸擬合，得到綠豆芽豆比（Y）對浸泡時間（A）、發芽溫度（B）、淋噴間隔（C）的二元多項回歸方程如下。

黑皮綠豆：Y1=5.92-0.091A-0.34B+0.097C+0.075AB-0.28AC+0.18BC-0.51A2-0.45B2-0.25C2；綠皮綠豆：Y2=7.54-0.13A-0.27B+0.17C-0.058AB-0.56AC+0.24BC-0.88A2-1.18B2-0.24C2。

黑皮綠豆方差分析見表3，黑皮綠豆的回歸模型P 值＜0.000 1，表現為極顯著，失擬項 P=0.051 1＞0.05，表現為差異不顯著，確定系數R2=0.982 2，校正系數R2Adj=0.959 3，綜合說明該模型對試驗擬合度較好，可以對芽豆比進行分析和預測。一次項A、B、C均達到顯著水平，由F值可知，影響黑皮綠豆芽豆比的因素順序為：B（發芽溫度）＞C（淋噴間隔）＞A（浸泡時間），因素AC、BC、A2、B2、C2對芽豆比有極顯著影響，因素 AB 對芽豆比的影響不顯著。

表3 黑皮綠豆回歸方差分析Table 3 Analysis of variance of bivariate regression equation of black mung bean

綠皮綠豆方差分析見表4，回歸模型P值＜0.000 1，表現為極顯著，失擬項 P=0.072 3＞0.05，表現為差異不顯著，確定系數R2=0.989 3，校正系數R2Adj=0.975 6，綜合說明該模型對試驗擬合度較好，可以對芽豆比進行分析和預測。方差分析中A、B、C對芽豆比影響是顯著的，由F值可知，影響綠皮綠豆芽豆比的因素順序為：B（發芽溫度）>C（淋噴間隔）>A（浸泡時間），因素 AC、BC、A2、B2、C2對芽豆比有顯著影響，因素 AB對芽豆比的影響不顯著。

表4 綠皮綠豆回歸方差分析Table 4 Analysis of variance of bivariate regression equation of green mung bean

2.2.3 響應面交互作用分析

各因素交互作用對黑皮綠豆、綠皮綠豆芽豆比影響的響應面圖見圖4。

圖4 各因素交互作用的響應面圖Fig.4 Response surface diagram of the interaction of various factors

從響應面的等高線中可以看出，橢圓形即表示因素兩兩交互作用顯著，而圓形則相反。響應面的坡度變化反映出各因素變化時對應響應值的變化情況。圖4（a）等高線為圓形，即發芽溫度與浸泡時間的交互作用不顯著；由圖4（b）可知，當淋噴間隔一致時，芽豆比隨浸泡時間的升高顯著增加后下降，當兩者達到適宜條件時得到最佳效果；由圖4（c）可知，等高線為橢圓，淋噴間隔與發芽溫度的交互作用極其顯著，當淋噴間隔保持不變時，芽豆比隨發芽溫度的升高呈現緩慢上升后急劇下降的趨勢，當兩者達到適宜條件時得到最佳效果。圖4（d）等高線為圓形，即發芽溫度與浸泡時間的交互作用不顯著；如圖4（e）所示，當淋噴間隔一致時，芽豆比隨浸泡時間的升高顯著增加后下降，當兩者達到適宜條件時得到最佳效果；圖4（f）等高線為橢圓形，因此淋噴間隔與發芽溫度之間的交互作用對芽豆比的影響顯著，當兩者在適宜條件下對芽豆比的影響達到最大。

根據響應面優化分析得到不同種皮顏色綠豆發芽獲得最大經濟效益的最佳條件：黑皮綠豆浸泡時間為8.52 h，發芽溫度為25.28℃，淋噴間隔為6.31 h，此時芽豆比可獲最大值為5.99，根據試驗的可行性調整浸泡時間為9 h，發芽溫度為25℃，淋噴間隔為6 h，重復試驗3次，芽豆比平均值為5.80，擬合性較好；綠皮綠豆浸泡時間為11.35 h，發芽溫度為25.59℃，淋噴間隔為4.65 h，此時芽豆比可獲最大值為7.02，根據試驗的可行性調整為浸泡時間為11 h，發芽溫度為26℃，淋噴間隔為5 h，重復試驗3次，芽豆比平均值為6.83，擬合性較好。

2.3 綠豆萌發過程中抗氧化活性物質變化

綠豆萌發過程中抗氧化活性物質變化見圖5、圖6。

圖5 黑皮綠豆萌發過程中抗氧化活性物質變化Fig.5 Changes of antioxidant substances in black mung bean during germination

圖6 綠皮綠豆萌發過程中抗氧化活性物質變化Fig.6 Changes of antioxidant substances in green mung bean during germination

2.3.1 總酚含量

酚類物質是植物次生代謝的產物，為植物的生長和繁殖提供必要的能量[20-21]。流行病學研究表明，人類飲食中的酚類化合物可能有降低慢性病風險的益處[22]。由圖5和圖6可知，黑皮綠豆發芽過程中總酚含量變化呈先下降后上升趨勢，在萌發96 h達到最大為4.63 mg GAE/g，相較未萌發的綠豆，總酚含量增加1.45倍。綠皮綠豆不同發芽時期總酚含量差異顯著，隨萌發時間的延長呈現先上升后下降再上升的趨勢，72 h的總酚含量低于48 h，盡管含量有所下降但是仍比未萌發種子高出29.7%，96 h多酚含量達到峰值，含量為6.25 mg GAE/g，此時總酚含量是未萌發綠豆籽粒的2.04倍。Cevallos等[23]的研究中表明，黃豆發芽萌發到96 h時總酚含量增加近1.6倍。

2.3.2 總黃酮含量

黃酮類化合物是酚類化合物家族中的一個主要類別，具有抗氧化性和生物活性，黃酮類化合物已在水果、蔬菜和其他植物性食物中得到鑒定。黃酮與降低主要慢性疾病的風險有關[12]。由圖5和圖6可知，黑皮綠豆發芽過程中總黃酮變化趨勢呈先下降后上升的趨勢，在發芽96 h達到最大為4.14 mg RE/g，是未萌發綠豆的1.06倍。綠皮綠豆萌發后總黃酮含量變化趨勢與黑皮綠豆基本保持一致，發芽24 h急劇下降，此時總黃酮含量相較未發芽綠豆減少了34%，發芽48 h～96 h總黃酮含量逐漸上升，在96 h達到最大值為5.16 mg RE/g，是未萌發綠豆的1.58倍。

2.3.3 DPPH自由基清除率

由圖5、圖6可知，黑皮綠豆自由基清除率在發芽24 h逐漸降低，第48 h急劇上升，72 h含量下降后又急劇上升，呈“W”型變化趨勢，96h含量高達43.21%，整個萌發過程自由基清除率相較未萌發綠豆高出2.86倍。綠皮綠豆發芽24 h～48 h自由基清除率急劇上升，整體呈現快-慢-快的上升趨勢，96 h自由基清除率達到最大，為47.75%，相比于未發芽綠豆高出5.5倍。Huang等[24]研究表明綠豆芽菜DPPH自由基清除率要高于大豆芽。

2.4 綠豆萌發過程中營養物質變化

2.4.1 淀粉及可溶性糖含量

綠豆萌發過程中淀粉及可溶糖含量變化見圖7。

圖7 不同品種綠豆萌發過程中可溶性糖與淀粉含量變化Fig.7 Changes of soluble sugar and starch content in different varieties of mung bean during

由圖7可知，黑皮綠豆的淀粉在發芽72 h有顯著上升趨勢，隨后淀粉含量急劇下降。該變化趨勢與趙天瑤等[25]研究結果一致。在發芽96 h黑皮綠豆淀粉含量高于綠皮綠豆。綠皮綠豆在發芽24 h相比未發芽的綠豆淀粉含量顯著升高，此后淀粉含量逐漸下降。不同顏色的綠豆萌發過程中可溶性糖含量呈現平緩上升的變化趨勢，萌發96 h可溶性糖含量分別為17.34%和20.71%，相較未發芽綠豆增加51.6%和40.5%。

2.4.2 蛋白質及可溶性蛋白含量變化

綠豆萌發過程中蛋白質及可溶性蛋白含量的變化見圖8。

圖8 不同品種綠豆萌發過程中可溶性蛋白與蛋白質含量變化Fig.8 Changes of soluble protein and protein content in different varieties of mung bean during germination

從圖8可以看出，不同顏色的綠豆隨萌發時間的延長，豆芽的可溶性蛋白的含量逐漸降低，萌發96 h下降速度達到峰值。此時兩個品種的綠豆芽菜可溶性蛋白最低值為18.2 mg/g和19.6 mg/g，分別較未萌發綠豆下降59.8%和53.2%。相反，黑皮綠豆和綠皮綠豆粗蛋白質含量隨時間延長呈上升趨勢，萌發96 h時蛋白質含量達到峰值為32.1 g/100 g和33 g/100 g，此結果與趙天瑤等[25]與高立城等[26]得到的芽苗菜在發芽96 h蛋白質含量逐漸增加的結果基本相似。此外，綠皮綠豆的蛋白質含量高于黑皮綠豆，但是綠皮綠豆的可溶性蛋白含量低于黑皮綠豆。

3 討論

本試驗對最佳發芽條件優化后發現兩個粒色的綠豆的最佳發芽條件存在差異，究其原因可能由于兩者的基因型存在較大差異。此外，黑皮綠豆的籽粒較大，種皮相對較厚，對于水分的需求高于綠皮綠豆，因此浸泡時間，發芽溫度與淋噴間隔均大于綠皮綠豆。

本試驗對綠豆萌發過程中抗氧化活性物質測定后發現，不同粒色綠豆隨萌發延長總酚含量逐漸上升，酚類物質的合成可能是為了滿足自身結構生長和對環境中不利因子的抵抗作用所需。綠豆籽粒發芽后總酚含量的增加可能由于咖啡酸、阿魏酸、沒食子酸、對香豆素等酚類化合物含量的升高所致。有研究表明綠皮綠豆芽菜比黑皮綠豆芽菜合成和積累酚類化合物的速度更快，這與本研究結果一致。其原因可能是因為綠皮綠豆苯丙氨酸解氨酶的活性更高，誘導合成肉桂酸從而增加了酚類物質的含量[27]；不同品種的綠豆總黃酮含量為4.14 mg RE/g和5.16 mg RE/g，曹菲菲等[28]在20℃下進行綠豆發芽試驗測定96 h時總黃酮含量為2.8 mg/g，小于本試驗總黃酮含量，其原因可能由于品種不同，或發芽溫度過低限制黃酮合成物質的產生從而引起含量過低；DPPH自由基含量在發芽96 h顯著增加，Huang等[24]試驗表明，綠豆萌發后DPPH自由基清除率較未萌發綠豆高出260%，與本試驗結果有較大偏差，或因為測定方法不同導致。此外，綠皮綠豆芽菜的抗氧化能力與黑皮綠豆芽菜的抗氧化能力不同，這可能部分是由于蘆丁僅存在于綠皮綠豆牙菜中以及綠皮綠豆中其他抗氧化酚的快速合成導致[29]。

通過研究綠豆萌發過程中營養物質變化發現，在發芽進行到24 h時淀粉與可溶性糖的含量都在上升。此后，淀粉與可溶性糖的變化基本呈相反趨勢，原因可能是在發芽初始階段脂肪不斷被降解并轉化為糖類物質，導致淀粉含量上升；隨著發芽時間延長，芽體增長迅速，種子呼吸作用加強，脂肪的降解速率降低，胚乳中的干物質轉化為可溶性物質，淀粉酶等水解酶類活性增強，淀粉被降解為可溶性糖等小分子糖類化合物，為呼吸等生理活動提供了充足的底物，以免本身的滲透調節機制免遭破壞，維持豆芽正常生長[30-31]。這兩種生理變化使得前期淀粉與可溶性糖含量增加，而后期可溶性糖的轉化率不斷增加，淀粉含量逐漸下降[32]；同時可溶性蛋白與粗蛋白質含量也呈相反的趨勢變化。本研究中兩個品種的綠豆可溶性蛋白含量逐漸下降，而蛋白質含量逐漸升高，主要原因為蛋白質主要在蛋白質合成酶作用逐漸將可溶性蛋白轉化為蛋白質。Khalil等[33]報道稱發芽的鷹嘴豆發芽后碳水化合物主要作為萌發時期的底物被消耗，而發芽引起的蛋白酶含量增加導致蛋白質水平的增加。

4 結論

（1）通過單因素試驗與響應面優化試驗分析得到各因素對芽豆比的影響順序為發芽溫度>淋噴間隔>浸泡時間。黑皮綠豆最適宜在浸泡9 h，發芽溫度為25℃，淋噴間隔為6 h條件下萌發；綠皮綠豆最適宜在浸泡時間為11 h發芽溫度為26℃，淋噴間隔為5 h條件下萌發。

（2）本試驗對不同粒色綠豆在最佳發芽條件下進行了萌發，隨著發芽時間的延長，綠豆芽菜中總酚、總黃酮及DPPH自由基清除率均有不同程度提升，可溶性蛋白和粗蛋白質含量與淀粉和可溶性糖含量均隨時間的延長呈相反的變化趨勢。因此，綠豆芽菜是獲取豐富營養物質性極好的資源，可作為保健食品的加工原料。