醬香型白酒釀造酒醅中產香芽孢桿菌的分離鑒定

戴奕杰，楊文佳，劉 燕

(1.貴陽學院生物與環境工程學院，貴州貴陽 550005；2.貴州省山地珍稀動物與經濟昆蟲重點實驗室,貴州貴陽 550005)

中國傳統白酒與白蘭地、威士忌、伏特加、杜松子酒和朗姆酒并稱為世界六大蒸餾酒。作為我國一種傳統的糧食發酵蒸餾酒，白酒釀造以高粱為原料，大曲作為糖化發酵劑，通過固態微生物發酵、固態蒸餾、貯存和勾兌生產而成。我國白酒歷史悠久，是全球白酒行業的重要貢獻者。根據其獨特的香氣特征，可將中國白酒劃分為12 類，其中濃香型白酒、清香型白酒、醬香型白酒、米香型白酒是我國白酒的四大基礎酒類。

醬香型白酒生產工藝復雜，距今已有上千年歷史，經兩次投料（下沙、糙沙）、九次蒸煮、八次發酵以及七次蒸餾取酒，最終貯存、勾兌、調味、貯存而成。

堆積發酵是醬香型白酒生產過程中非常關鍵的一個環節。這個階段涉及的微生物群落結構的動態變化十分復雜，細菌、酵母等迅速生長繁殖，并產生多種酶類和其他代謝物質。原料中的蛋白質在這些酶的作用下被水解成各種氨基酸，酶與各代謝物質間也會相互作用發生美拉德反應和其他化學反應，促進具有醬香風味的化合物的生成，賦予白酒獨特風味特征。Wang 等通過16S、18S rRNA 基因測序技術研究了大曲、高粱及空氣、窖池、窖泥等3 個發酵谷物樣品和12 個環境樣品中的微生物群落組成，得出細菌主要來源于大曲，其次是空氣、窖泥和高粱。高溫大曲（60～65 ℃）的優勢菌群是細菌，而非真菌，原因在于芽孢桿菌等部分細菌能夠適應高溫等環境條件。醬香型白酒發酵過程中，高溫大曲中的細菌及其代謝產物對于最終白酒的風味和質量至關重要。

Wang 等使用表型分類和常規生化鑒定大曲中的微生物群落結構。得出優勢細菌屬為芽孢桿菌屬（）、醋桿菌屬（）、乳桿菌屬（）和梭菌屬（），其中芽孢桿菌屬菌株數量最多。有學者研究了茅臺酒發酵過程中的細菌群落結構，發現大曲成熟期的主要優勢菌為芽孢桿菌科，且該菌同為堆積發酵前期和窖池發酵厭氧階段的優勢菌。芽孢桿菌屬于嗜熱性細菌，發酵后期迅速生長繁殖，釋放大量熱量。研究發現芽孢桿菌內生孢子的耐熱性是由spo-VA2moboperon 介導的。且研究證明：、和能 夠代謝產生丙酸、1，3-丁二醇、乙酸、甲酯等物質，其中大部分物質是醬香型白酒中常見的揮發性風味物質。

高溫大曲生產和堆積發酵過程中的優勢菌是芽孢桿菌，對醬香型白酒的品質具有一定的貢獻作用。堆積發酵及入窖發酵過程中微生物種類繁多、復雜多變，對其中優勢菌株進行篩選并將其作為功能發酵劑充分利用是目前的研究熱點。

本研究通過選擇性培養基從傳統醬香型白酒釀造工藝中的窖池厭氧發酵的酒醅中篩選得到1株產香菌株，通過進一步形態學觀察、生理生化試驗及分子生物學方法確定該菌株為解淀粉芽孢桿菌，為今后該菌株發酵性能的研究及白酒釀造工藝中功能發酵劑的挖掘奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 樣品采集

按照傳統醬酒的釀造工藝，本研究對某醬香型白酒生產企業進行實地采樣。選取同一窖池七個輪次窖池發酵工序的酒醅，根據如圖1 的9 個取樣點的位置進行取樣，每輪次取樣量保持一致。將收集到的9 個取樣位置的酒醅混合均勻后，分裝于無菌袋封裝標記，置于4 ℃的冰箱保存備用。

圖1 窖池發酵酒醅取樣示意圖

1.1.2 培養基與試劑

培養基：肉湯（瓊脂）培養基購于北京陸橋技術股份有限公司。

試劑：GN、BCL 反應卡購買于梅里埃（VITEK2）；16S 引物（F16S-27、R16S-1492）、2×Rapid Taq Master Mix、回收試劑盒（NEP025-1 50T）均來自北京鼎國昌盛生物技術有限公司。

1.1.3 儀器設備

恒溫培養箱（HPX9272MBE），上海博訊；均質器，梅里埃（Smasher）；PCR儀（DL9700 96孔），東林昌盛；恒溫孵育器，鼎國昌盛；全自動微生物分析系統，梅里埃（VITEK2）。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的分離純化

稱取25 g 七個輪次混勻后的酒醅，放置于盛有225 mL 無菌生理鹽水的均質袋中，用均質器拍打1 min，制成1∶10 的菌懸液。用無菌吸管吸取1 mL 的1∶10 菌懸液，注入盛有9 mL 無菌生理鹽水的無菌試管中，振搖試管混合均勻，制成1∶100 的樣品勻液。重復上述操作進行梯度稀釋至10，然后分別吸取10 μL 不同稀釋度（10～10）的菌懸液于肉湯（LB）瓊脂培養基中進行涂布，每個稀釋度涂布兩個平皿。將平板置于30 ℃恒溫培養箱中倒置培養1 d。挑取多個不同形態的單個菌落，于培養基上進行劃線以純化菌株，每日觀察并記錄菌落的生長情況。

1.2.2 菌株的保藏

挑取純化好的單個菌落于肉湯瓊脂斜面培養基中劃線，將斜面培養基置于30 ℃培養箱中培養，菌落長滿斜面后，將培養基置于4 ℃冰箱中保藏。每三個月需將試管中的菌種傳代一次，保證其活力。

1.2.3 菌株的鑒定

挑取斜面培養基中的菌種在肉湯瓊脂培養基中劃線，置于30 ℃培養基中培養48 h 以活化菌種，以備優勢菌株的形態學觀察、生理生化鑒定及分子生物學鑒定。

1.2.3.1 形態學觀察

菌落形態觀察：將活化好的菌株接種至LB 固體培養基和液體培養基中，30 ℃培養，每天觀察并記錄固體培養基上菌落的顏色、形狀、光澤、突起程度、邊緣形狀等。

細胞形態：無菌操作下，挑取菌株于載玻片上進行革蘭氏染色，于100×油鏡下觀察其顏色變化及細胞形態特征。

革蘭氏染色法：參考《微生物學實驗教程》（第三版）進行。

1.2.3.2 生理生化鑒定

菌株生理生化鑒定通過全自動微生物鑒定系統VITEK?2 Compact 實現。包括：革蘭氏陽性菌鑒定卡（GP）、芽孢菌鑒定卡（BCL）。主要操作流程為：挑取單個優勢菌進行純培養，制備一定濃度的菌懸液，將卡片按順序放在載卡架上，將導液管插入菌懸液中，上機測試。2～10 h 系統自動打印鑒定結果。

1.2.3.3 分子生物學鑒定

根據操作步驟使用試劑盒提取待待測菌株的總DNA。使用引物F16S-27（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）和R16S-1492（CGGTTACCTTGTTACGACTTC）擴增菌株的目的片段。PCR 擴增過程如下：94 ℃初始變性5 min，進行35 個循環，即94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循環結束后，72 ℃單次延伸10 min，最后在4 ℃孵育結束。PCR 反應體系為：25 μL 的2×Rapid Taq Master Mix，10 μM的每個引物（1.0 μL），1.0 μL 的模板DNA及22.0 μL 的ddHO。1 %的瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物。

在NCBI 網站將獲得的基因序列進行BLAST（Basic Local Alignment Search Tool），選取數據庫中與測定序列同源性高于99 %的序列進行比對，將得到的比對結果使用MEGA 軟件中的Neighborjoining算法構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 產香菌株的篩選

每個稀釋度（10～10）的平板上挑取20 個菌落進一步分離純化，觀察菌株在LB 固體培養基上的菌落形態和細胞形態特征，七輪次混合酒醅中共分離到12 株菌落形態不同的菌，結合革蘭氏染色結果，12 株菌落形態不同的菌中6 株菌為革蘭氏陽性菌，其在肉湯瓊脂培養基上的菌落形態和細胞形態如表1所示。

表1 菌株的菌落形態和細胞形態

為判斷各菌的產香性能，將篩選到的6 株革蘭氏陽性菌DAI bj-1、DAI bj-2、DAI bj-3、DAI db-1、DAI db-2、DAI db-3 接種至肉湯液體培養基（試管）中，分別編號為1、2、3、4、5、6，于30 ℃培養5 d，通過感官評價試管內的香氣特征進行復篩，結果如表2所示。

表2 菌株香氣特征

由表2 可知，除4 號、6 號試管無明顯香味外，其余4 支試管均有一定的清香味，1 號、3 號試管香氣特征相似，菌株生長較旺盛，香氣強度均高于2號、5 號試管，且均具有一定的醬香味，但3 號試管除醬香外還有微微的酸味，2 號試管具有淡淡的酯香味。因此從篩選到的6 株菌中選用綜合產香性能較優的DAI bj-1作為目標菌株。

2.2 形態學觀察

菌株DAI bj-1 菌落形態與細胞形態如圖2 所示，由圖2 可知，純化后的單個菌落在LB 固體培養基上形狀為圓形，顏色呈淡黃色，邊緣不規則，中間突起不透明，表面濕潤。挑取單個菌落于載玻片上通過革蘭氏染色法于顯微鏡下觀察到該菌株的細胞形態為：形狀呈桿狀，革蘭氏染色結果為陽性。

圖2 菌株的菌落形態（a）和細胞形態（b）

2.3 生理生化鑒定

由菌株DAI bj-1的形態學觀察結果，可初步得到該菌為革蘭氏陽性菌，因此可通過VITEK? 2 Compact 系統中的革蘭氏陽性菌鑒定卡（GP）和芽孢菌鑒定卡（BCL）進一步確定。該全自動微生物鑒定系統可快速、高效、準確地通過各生理生化試驗確定該菌株。其GP 和BCL 鑒定結果如表3、表4所示。根據最終結果報告顯示：革蘭氏陽性菌鑒定卡（GP）中，苦杏仁苷（AMY）、D-甘露糖（dMNE）、D-半乳糖（dGAL）、α-葡萄糖苷酶（AGLU）、水楊素（SAL）等21 項結果呈陽性，磷酸酶（PHOS）、D-木糖（dXYL）、α-半乳糖苷酶（AGAL）、β-D-葡萄糖苷酸酶（BGUR）等22 項結果呈陰性；芽孢菌鑒定卡（BCL）中，β-木糖苷酶（BXYL）、丙酮酸鹽（PVATE）、肌醇（INO）、D-葡萄糖（dGLU）、腐胺同化（PSCNa）等32 項結果呈陽性，磷酰膽堿（PHC）、L-脯氨酸芳胺酶（ProA）、N-乙酰-D-氨基葡萄糖（NAG）、麥芽三糖（MTE）等14 項結果呈陰性。根據VITEK? 2 Compact 全自動微生物鑒定系統中的GP、BCL結果，判斷該菌株可能為芽孢桿菌。

表3 VITEK 2 GP鑒定結果

表4 VITEK 2 BCL鑒定結果

2.4 系統發育樹的建立

為驗證VITEK? 2 Compact 全自動微生物鑒定系統結果的準確性及確定酒醅中分離到的菌株DAI bj-1 為哪種芽孢桿菌，提取該菌株DNA 后，PCR擴增上機測序。

將測序所得的該菌株的基因序列與NCBI在線基因數據庫中的已知序列進行比對，按照相似性高低進行排序后得到：菌株DAI bj-1的基因序列與數據庫中的strain Ba13（Sequence ID：MG846076.1）具有99.93 %的相似性。選取Genbank 數據庫中與測試菌株的序列同源性較高的已知菌株的序列進行多序列比對，將比對結果通過Mega-X 軟件使用Neighbor-joining 算法構建系統發育樹圖3。

由圖3 可知，菌株DAI bj-1 為芽孢桿菌，且其與的遺傳進化距離接近，位于同一個分支。因此，結合形態學、生理生化鑒定結果，可確定，傳統醬香型白酒釀造工藝中的窖池厭氧發酵的酒醅中篩選出的優勢菌為解淀粉芽孢桿菌（）。

圖3 菌株系統發育樹

3 討論

本研究涉及了一種全自動微生物分析系統（VITEK 2 Compact），該鑒定系統通過改良后的氧化、水解等生化反應，可實現細菌的鑒定和藥敏試驗。其自動化程度高，與PCR 檢測技術、API 鑒定系統鑒定出的結果具有較高的符合率，具有快速、高效及較高的準確性、可重復性和安全性等特點，因此可廣泛應用于食品中各類微生物的鑒定分析。

醬香型白酒共經歷兩次投料（下沙、糙沙）、九次蒸煮、八次發酵以及七次蒸餾取酒，受到發酵溫度、酒醅中水分含量、酸度及糊化程度等影響，不同輪次酒醅中的微生物多樣性存在一定的差異性。在這復雜的工藝過程中，酒醅中的微生物資源豐富，芽孢桿菌屬（）、片球菌屬（）、乳桿菌屬（）、梭形桿菌屬（）、假絲酵母屬（）、曲霉屬（）等微生物迅速生長繁殖，成為優勢微生物，對醬香型白酒產品良好品質的形成具有重要意義。

芽孢桿菌作為酒醅中的主導功能性細菌，在不同輪次酒醅中呈先上升后下降，最后趨于穩定的變化趨勢。該菌屬對醬香型白酒品質的影響主要體現在其代謝產生的蛋白酶、淀粉酶等多種酶類能將酒醅中豐富的蛋白質、糖類等大分子物質水解成多種風味前體物質，在改善產品風味的同時賦予其獨特的風味特征。羅建超等從大曲中分離篩選的解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等產香菌，其代謝產物有2,6-二甲基吡嗪、β-苯乙醇、3-羥基-2-丁酮和異戊酸等10種風味物質。

解淀粉芽孢桿菌作為芽孢桿菌屬的一種，無毒無害，對抗生素敏感，具有良好的乙醇、牛膽汁耐受能力，能分泌木聚糖酶、β-葡聚糖酶、淀粉酶等多種酶類及胞外多糖，在促進營養物質吸收、抑制病原菌、免疫調節等方面發揮重要作用。為了改善白酒中典型風味物質減少這一現象，有學者將篩選到的解淀粉芽孢桿菌作為發酵劑接種至冷卻后的蒸糧中堆積發酵一定時間后，發酵初期芽孢桿菌的相對豐度從82.14%增加到88.47%,與對照組相比，酒醅和白酒中的四甲基吡嗪含量分別增加了26倍和24 倍,該物質不僅是一種含氮雜環化合物，賦予白酒焦糊和烤芝麻香氣，它還是具有多種生物活性的潛在功能成分。結合感官分析，得出解淀粉芽孢桿菌在增強白酒香氣的同時還具有改善產品質量等作用。此外，某些極端環境條件有利于芽孢桿菌的生長繁殖，因此該菌在工業酶制劑生產方面也具有廣大的應用前景。

本研究從七輪次混合的酒醅中分離篩選到了一株產香芽孢桿菌，通過觀察該菌在LB 固體培養基上的菌落形態及細胞形態特征，結合全自動微生物生理生化鑒定系統及分子生物學等鑒定方法，最終確定該菌株為解淀粉芽孢桿菌（）。目前，已有研究證明該菌對白酒風味具有貢獻作用，因此，將其作為發酵劑按照相應比例添加至白酒中進行發酵，測定并分析其與未接種發酵劑的白酒相比風味成分的差異，初步建立了解淀粉芽孢桿菌與白酒風味物質間的聯系。同時可進一步研究剖析該菌的發酵性能及其代謝途徑，了解該菌對白酒品質的具體作用機制，在此基礎上，將其作為功能發酵劑對調控各類白酒風味、質構等品質具有巨大的發展潛力。