機(jī)制高溫曲生產(chǎn)工藝的分析研究

王邦坤，劉民萬，董偉杰，鄭世武，張世文

（山東青州云門酒業(yè)(集團(tuán))有限公司，山東青州 262500）

制曲技術(shù)是我國特有的一份民族遺產(chǎn)，其歷史尚不足500 年。曲為酒骨，制曲工藝是中國白酒工藝的重要組成部分。“自然富集、開放作業(yè)、堆積升溫、翻轉(zhuǎn)調(diào)節(jié)、排潮降溫、總溫控制”是大曲培養(yǎng)的共同機(jī)理。高溫大曲要求在較高的溫度下培養(yǎng)，以產(chǎn)生類似醬香的香氣。熟悉大曲的生產(chǎn)特點(diǎn)，抓住關(guān)鍵環(huán)節(jié)，才能生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)高溫大曲以保證產(chǎn)品質(zhì)量。任何微生物的培養(yǎng)都受養(yǎng)料、水分、pH 值、氧氣、溫度等因素的影響，其中養(yǎng)料的不同和水分的大小對發(fā)酵的過程控制尤為明顯。關(guān)注原料質(zhì)量，在曲坯壓制、曲房培養(yǎng)、出房貯存等階段，結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際探討機(jī)制高溫曲制作過程相關(guān)的技術(shù)問題。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

材料：本研究用高溫大曲為云門酒業(yè)制曲中心生產(chǎn)。

試劑：本研究所用試劑均為分析純及以上級別，溶液均由蒸餾水配制。

儀器設(shè)備：GY-1500F 生化培養(yǎng)箱（常州華普達(dá)儀器有限公司）；立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博訊實(shí)業(yè)公司）；XSP-2CA 顯微鏡（上海光學(xué)儀器）；CJ-2D-F 超凈工作臺（天津市泰斯特儀器公司）；7820 型氣相色譜儀（美國Agilent 公司）；電子天平（上海津平科學(xué)儀器有限公司）；氣質(zhì)聯(lián)用儀，配有EI 離子源，色譜柱型號：DB-FFAP 60 m×0.25 mm×0.2 μm；CAR/DVB/PDMS 萃 取 頭(Agilent 7890-5975，美國)；高通量測序平臺。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)流程

本研究采用流程如下：

原料質(zhì)量鑒定→粉碎→母曲→加水拌料→壓曲→晾曲→入房→翻曲→出房→貯存→使用

1.2.2 試驗(yàn)檢測方法

1.2.2.1 感官質(zhì)量鑒評及溫度

小麥原料質(zhì)量鑒定采用感官法；原糧粉碎度通過20 目篩進(jìn)行測定；曲坯發(fā)酵溫度及室溫采用溫度計(jì)法。

1.2.2.2 其他指標(biāo)測定

大曲水分、酸度、糖化力、發(fā)酵力、液化力等參考標(biāo)準(zhǔn)QB/T 4257—2011，其中液化力、糖化力、酯化力測定具體方法如下。

1.2.2.2.1 液化力

方法提要：利用淀粉能與碘產(chǎn)生藍(lán)色反應(yīng)的特性，試樣浸出液在35 ℃，pH4.6 溶液中酶解至試液對碘的藍(lán)紫色特征反應(yīng)消失。根據(jù)所需時間計(jì)算1 g 絕干曲在該條件下l h 能液化淀粉的克數(shù)，表示液化力的大小。

分析步驟：

5%酶液制備：根據(jù)測得的試樣水分，稱取相當(dāng)于10 g 絕干試樣量，精確至0.01 g，于250 mL 燒杯中，根據(jù)試樣水分計(jì)算加水量，加pH4.6 緩沖液20 mL 后總體積為200 mL，充分?jǐn)嚢琛糜?5 ℃恒溫水浴鍋中保溫浸漬1 h過濾備用。

測定：取20 mL 可溶性淀粉于試管中，加5 mL的pH4.6緩沖液搖勻，于35 ℃水浴中預(yù)熱至試液為35 ℃時，加入10 mL 5%酶液充分搖勻并立即計(jì)時，定時用吸管吸取0.5 mL 反應(yīng)液注入預(yù)先裝了5 mL稀碘液的試管中起呈色反應(yīng)，或?qū)⒎磻?yīng)液放入盛有約1.5 mL 稀碘液的白瓷板中，直至碘液不顯藍(lán)色(或與標(biāo)準(zhǔn)比色液對比)為終點(diǎn)，記下反應(yīng)時間t。

計(jì)算結(jié)果：

式中：X——試樣的液化力，U；

20——可溶性淀粉毫升數(shù)，mL；

0.02——可溶性淀粉濃度，g/mL；

V——酶液定容體積，mL；

60——1小時之分鐘數(shù)；

t——反應(yīng)完結(jié)耗用時間，min。

1.2.2.2.2 糖化力

方法提要：大曲中糖化型淀粉酶能將淀粉水解生成葡萄糖。試樣在規(guī)定條件下從淀粉的非還原性末端開始依次水解α-1,4-葡萄糖苷鍵產(chǎn)生葡萄糖，用斐林法測定所生成的葡萄糖量，以此來表示糖化力。

分析步驟：

大曲樣液的制備(50 g/L)：根據(jù)測得大曲試樣的水分，稱取相當(dāng)于絕干試樣量10 g，精確至0.01 g放入250 mL 燒杯中，加20 mL 乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，再加水，用玻璃棒攪拌均勻，定容至200 mL。將上述燒杯置于35 ℃恒溫水浴中保溫浸漬1 h，過濾，收集濾液，備用。

測定：于一試管內(nèi)加入25.0 mL 可溶性淀粉溶液，再加5.0 mL 大曲樣液，搖勻，加入20 % NaOH溶液l mL 后，吸取5.0 mL 作為空白溶液，用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，記錄其消耗體積V，操作程序同測定淀粉含量步驟；于另一試管內(nèi)加入25.0 mL 可溶性淀粉溶液，再加5.0 mL 大曲樣液，搖勻，置于35 ℃恒溫水浴中，準(zhǔn)確計(jì)時，糖化l h，加入20 %NaOH 溶液l mL 后，吸取糖化液5.0 mL 于盛有斐林溶液甲、乙液各5.0 mL 的錐形瓶中，加水10 mL，用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，記錄其消耗體積V，操作程序同測定淀粉含量步驟。

結(jié)果計(jì)算：

試樣的糖化力按以下公式計(jì)算。

式中：X——試樣的糖化力，U；

V——滴定空白時，消耗葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL：

V——滴定試樣時，消耗葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；

2.5——每毫升葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液中含有葡萄糖的質(zhì)量，mg；

30——糖化混合液(可溶性淀粉溶液加大曲樣液)的總體積，mL；

0.25——5 mL大曲樣液相當(dāng)大曲的質(zhì)量，g；

5——滴定時吸取的糖化液體積，mL。

1.2.2.2.3 酯化力

在規(guī)定的試驗(yàn)條件下，大曲中酯化酶催化游離有機(jī)酸與乙醇合成酯，再用皂化法測定所生成的總酯(以己酸乙酯計(jì))，表示其酯化力。

分析步驟：

酯化樣品的制備：吸取1.5 mL 己酸于250 mL錐形瓶中，加25.0 mL 無水乙醇，稍微振蕩后，加入75 mL 蒸餾水，充分混勻。再稱取相當(dāng)于絕干試樣量25 g，精確至0.01 g，加到錐形瓶中，搖勻后，用塞子塞上，置于35 ℃恒溫箱內(nèi)保溫酯化7 d，同時做空白試驗(yàn)。

蒸餾：將酯化7 d后的試樣溶液全部移入250 mL蒸餾瓶中，量取50 mL 乙醇溶液分?jǐn)?shù)次充分洗滌錐形瓶，洗液也一并倒入蒸餾燒瓶中，用50 mL 容量瓶接受餾出液(外用冰水浴)，緩緩加熱蒸餾，當(dāng)收集餾出液接近刻線時，取下容量瓶，調(diào)液溫20 ℃，用水定容，混勻備用。

皂化、滴定：將上述餾出液倒入250 mL 具塞錐形瓶中，加兩滴酚酞，以氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液中和(切勿過量)，記錄消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積。再準(zhǔn)確加入25.0 mL氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，搖勻，裝上冷凝管，于沸水浴上回流0.5 h，取下，冷卻至室溫。然后，用硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行反滴定，使微紅色剛好消失為其終點(diǎn)，記錄消耗硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積V。

結(jié)果計(jì)算：

試樣的總酯含量(以己酸乙酯計(jì))按公式(1)和公式(2)計(jì)算。

式中：A——測定總酯含量(以己酸乙酯計(jì))，g/L；

C——?dú)溲趸c標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L；

25.0——皂化時，加入0.1 mol/L 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；

C——硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度，mol/L；

V——滴定時，消耗0.1 mol/L硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；

0.1.2——與1.00 mL 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液[c(NaOH)=1.000 mol/L]相當(dāng)?shù)囊钥吮硎镜募核嵋阴サ馁|(zhì)量

50.0——樣品體積，mL；

A——試樣總酯含量(以己酸乙酯計(jì))，g/L；

A——未扣除空白試樣所測總酯含量(以己酸乙酯計(jì))，g/L；

A——空白試驗(yàn)所測總酯含量(以己酸乙酯計(jì))，g/L。

試樣的酯化力按下式計(jì)算：

式中：X——試樣的酯化力(以己酸乙酯計(jì))，U；

A——餾出液的總酯，g/L；

50——取樣體積，mL；

2——大曲酶活單位折算系數(shù)。

1.2.3 原酒微量成分分析

1.2.3.1 GC-FID儀器分析

氣相色譜儀，備有自動進(jìn)樣器和氫火焰離子化檢測器(FID)；毛細(xì)管柱：CP-Wax 57 CB (50 m×0.25 mm×0.2μm)；載氣(高純氮)：流速1 mL/min，分流比：10∶1；氫氣：流速為45 mL/min；空氣：流速為450 mL/min；檢測器溫度：270 ℃；進(jìn)樣器溫度：240 ℃。柱溫：起始溫度35 ℃，恒溫6 min，以4 ℃/min 程序升溫至60 ℃，以6 ℃/min 程序升溫至110 ℃，恒溫3 min，以6 ℃/min 程序升溫至205 ℃，繼續(xù)恒溫13 min。

進(jìn)樣量：1 μL。采用內(nèi)標(biāo)法，內(nèi)標(biāo)物選用常用的叔戊醇、乙酸正丁酯、2-乙基丁酸。

1.2.3.2 GC-MS定量分析法

色譜條件：載氣(高純氦氣)：純度≥99.999 %，流速1 mL/min，分流比2∶1；起始溫度50 ℃，保留2 min，然后以1.5 ℃/min升到85 ℃，再以3.5 ℃/min升到205 ℃，保留2 min。進(jìn)樣口溫度260 ℃。

質(zhì)譜條件：離子源230 ℃；傳輸線240 ℃；四級桿150 ℃；電子轟擊源：70 eV；掃描范圍：30～390 amu。定性采用全掃描模式(SCAN)，定量采用選擇離子掃描模式(SIM)。

樣品的制備和前處理方法：將目標(biāo)酒樣按標(biāo)識的酒精度，用去離子水稀釋到體積分?jǐn)?shù)10%，吸取10 mL 稀釋后的酒樣置于50 mL 容量瓶當(dāng)中,加入內(nèi)標(biāo)液使其終濃度為200 μg/L，然后用稀釋后的酒樣定容，吸取定容好的5 mL 樣品放入20 mL 頂空瓶中,加入NaCl 3 g，旋緊瓶蓋,置于55 ℃水浴鍋中，預(yù)熱10 min，恒溫萃取40 min，萃取完畢后將萃取頭取出,插入260 ℃進(jìn)樣口，解吸5 min。

1.2.4 菌種分析

高溫大曲細(xì)菌、真菌群落結(jié)構(gòu)分析采用高通量測序方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 進(jìn)廠原料質(zhì)量鑒定（表1）

表1 原料檢驗(yàn)結(jié)果

小麥淀粉含量高，麥膠蛋白和麥谷蛋白含量豐富，還含有少量葡萄糖、維生素及礦物質(zhì)，是細(xì)菌、霉菌等微生物繁殖產(chǎn)酶的良好載體。據(jù)報道大曲發(fā)酵初期細(xì)菌89.3 %來自于原料（小麥）。軟小麥雖然食用口感不佳，但質(zhì)軟易于微生物生長，踩制的曲子質(zhì)量好。

制曲用小麥最好用陳麥，避免用新糧。剛收獲的小麥，加水拌料后容易黏連，影響壓曲操作及入房后的發(fā)酵控制；另一方面，新糧中夾有麥糠、秸稈等雜質(zhì)，入曲倉后曲坯容易產(chǎn)生縫隙或內(nèi)部空洞，使曲塊產(chǎn)生裂紋，內(nèi)部產(chǎn)生青霉等雜菌。

2.2 原料粉碎度（表2）

表2 原料粉碎度

粉碎過粗，培曲過程中曲塊易掉邊、干裂，水分易揮發(fā)，不掛衣，曲塊易長毛霉、青霉，落溫快，后火無力；粉碎過細(xì)，出房后水分不易排盡，會形成“漚心”“鼓肚”等現(xiàn)象。

小麥粉碎要形成“芯爛皮不爛”的梅花瓣，以釋放淀粉，利于吸收水分，增大黏性。應(yīng)根據(jù)小麥水分、新鮮度等調(diào)整鋼磨，通過20 目篩進(jìn)行測定，要求細(xì)粉占40%～50%。

2.3 拌料水分結(jié)果（表3）

表3 拌料水分結(jié)果

小麥內(nèi)含水分一般＜12%，需要添加適量的凈水以滿足入房后制曲微生物生長繁殖的需求。高溫曲拌料水分較濃香、清香曲稍大些，為39 %～40%。制曲最忌貪水，若曲坯水分大，則曲心內(nèi)部水分、熱量、氣體通路被堵塞，易造成窩心曲、黑心曲，甚至招致大量細(xì)菌侵入，嚴(yán)重影響品質(zhì)。水量的精準(zhǔn)控制要求料準(zhǔn)、水準(zhǔn)、定速、定人、定檢。

2.4 母曲添加結(jié)果（表4）

表4 母曲部分理化指標(biāo)與菌屬比較

機(jī)械制曲曲坯壓制較緊，若母曲中耐熱芽孢桿菌數(shù)量偏少，曲坯入房后升溫緩慢發(fā)酵不均勻。由表4 可見，南方母曲含有的耐高溫芽孢桿菌明顯高于公司母曲，故將茅臺鎮(zhèn)優(yōu)質(zhì)大曲與公司母曲搭配使用，比例為6∶4，總量控制在5%～8%之間，所產(chǎn)高溫大曲質(zhì)量較好。

2.5 曲房溫度培養(yǎng)結(jié)果（表5）

表5 高溫大曲曲房培養(yǎng)記錄表

入房后溫濕度控制是重點(diǎn)。科學(xué)研究已表明，倉內(nèi)濕度對大曲微生物生長繁殖的影響作用大于倉內(nèi)溫度，二者也是相互關(guān)聯(lián)的。曲坯入房后，采用微機(jī)智能化控制曲房內(nèi)溫濕度品溫，專人負(fù)責(zé)監(jiān)控，適時調(diào)節(jié)倉內(nèi)溫度、濕度等發(fā)酵條件。曲坯各層間放置一定數(shù)量的木架，也能起到一定的隔離、調(diào)溫調(diào)濕的作用。入房頭幾天主要是保濕促溫，翻曲是散濕散溫，高溫期是控濕保溫，二翻之后是散濕保溫。

入房時間要趁早，采用多層排列方式，每層曲坯呈一字型排放。

第一次翻曲是制作高溫大曲的關(guān)鍵，適時翻曲就是要做到火候恰到好處，這樣的成品曲呈金黃色，曲香濃郁，并賦予原酒較多的香味物質(zhì)。第二次翻曲一般在一翻7～9 d后。

曲堆上面的蓋草不可過薄，不滴水即可。新舊稻草使用比例一般為4∶6，并灑適量溫水保潮。稻草不但起了隔離曲塊、調(diào)節(jié)曲塊溫濕度的作用，老稻草附著的釀酒微生物同時也起到了接種的作用。近來雖有不使用稻草、不翻倉、控溫控濕制曲的報道，短期內(nèi)尚無法替代稻草，稻草的重要性仍不容忽視。

2.6 高溫曲貯存期間成分變化(表6)

表6 高溫曲貯存期間成分變化

曲塊發(fā)酵到期后，將其移入干燥、通風(fēng)的貯曲庫進(jìn)行貯存、陳化。庫房貯存4～6 月即可粉碎、使用。隨著時間的延長，產(chǎn)酸細(xì)菌在干燥條件下逐漸干涸死亡，酵母數(shù)也呈下降態(tài)勢。

2.7 強(qiáng)化大曲釀酒結(jié)果(表7)

表7 強(qiáng)化大曲釀酒應(yīng)用結(jié)果 (μg/L)

利用微生物中心從高溫大曲、酒醅、操作場地中分離、培養(yǎng)地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、紅曲、放線菌等功能微生物，接種于曲料中進(jìn)行強(qiáng)化大曲培養(yǎng)。經(jīng)過試驗(yàn)的強(qiáng)化大曲用于釀酒，所產(chǎn)酒中β-苯乙醇、丁二酸二乙酯、糠醛、吡嗪類物質(zhì)的含量有明顯增長，突出了醬香型白酒的風(fēng)格特征。

3 結(jié)論

從各階段探討高溫曲制作工藝，從原料質(zhì)量鑒定、粉碎度控制、拌料水分、母曲選用、溫濕度調(diào)控、稻草使用、功能菌應(yīng)用等方面精心培曲，制定合理的貯存期限。

經(jīng)過持續(xù)的質(zhì)量改進(jìn)，不但明顯提升了云門醬釀酒品質(zhì)，大曲使用量也較以前降低了4 %～6%。公司目前正準(zhǔn)備擴(kuò)大制曲、釀酒生產(chǎn)能力及原酒存儲能力以確保產(chǎn)品質(zhì)量、滿足市場需求。