5 ℃貯藏條件下新鮮余甘子果實褐變相關(guān)指標研究*

李 蓉，龍小妹，陳 平，范 源，3△，朱培芳

（1.云南中醫(yī)藥大學中藥學院，云南 昆明 650500； 2.四川省中醫(yī)藥科學院轉(zhuǎn)化藥理與臨床應用研究所，四川 成都 610041； 3.云南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，云南 昆明 650216）

余甘子Phyllanthus emblicaL.為大戟科葉下珠屬植物，常以干燥成熟果實入藥。以“菴摩勒”為藥用之名，始載于《南方草木狀》；以“余甘子”為藥用之名，始載于《新修本草》［1］。余甘子藥材主要分布于熱帶及亞熱帶地區(qū)，是印度、中國、馬來西亞等國常用中藥材，已有700 余年的藥用歷史［2］，具有抗氧化、調(diào)血脂和降血糖活性［3］，且是許多保肝配方的重要成分，還可用作抗微生物劑、抗腫瘤劑或抗炎劑［4］，并可改善金屬誘導的致癌作用［5］。中醫(yī)學認為，中藥鮮品可保存藥材的大部分活性成分，故臨床應用價值高，但其在貯藏過程中可發(fā)生褐變，導致中藥活性成分含量或結(jié)構(gòu)改變而影響藥效［6］。余甘子果實褐變會引起其感官變差及多酚和維生素C 等營養(yǎng)物質(zhì)含量減少。多酚氧化酶（PPO）能將物質(zhì)氧化成醌類，從而引發(fā)褐變［7］。目前對余甘子果實貯藏保鮮技術(shù)的探討有限，僅對低溫貯藏、涂膜、高壓電場貯藏及添加酶抑制劑等措施有所研究［8］。新鮮余甘子果實中酚類化合物含量較高，沒食子酸為新鮮余甘子果實褐變的底物，可作為其發(fā)生早期褐變的指標之一［9］。某些黃酮類化合物可與某些酚、醌、氨基酸或蛋白質(zhì)直接聚合成褐色物質(zhì)導致褐變［10］。目前對新鮮中藥褐變機制的報道較少。為此，本研究中將新鮮余甘子果實置5 ℃恒溫冰箱中冷藏，測定其貯藏20 d 內(nèi)酚類成分含量、PPO 活性、pH、褐變指數(shù)等各項指標的變化情況，為新鮮果實類中藥的貯藏和養(yǎng)護提供一定參考。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；YL-040S 型語路超聲波清洗機（深圳市即潔超聲科技有限公司）；D2KW-D 型電熱恒溫水浴鍋（上海愛朗儀器有限公司）；S013 - 2100 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海量壹科學儀器有限公司）；T-1000型電子天平（上海浦春計量儀器有限公司）；PHS-25 型pH 計（上海儀電科學儀器股份有限公司）；Neofuge 15R 型離心機（上海力申科學儀器有限公司）；SPARK 10M 型酶標儀（澳大利亞Tecan公司）。

1.2 試藥

1-沒食子酰基葡萄糖（1-GG）對照品（上海葉源生物科技有限公司，批號為K28J12B136898）；沒食子酸（GA）對照品（四川省維克奇生物科技有限公司，批號為wkq16081904）；1，3，6-O-三沒食子酰基葡萄糖（TGG）對照品（武漢天植生物技術(shù)有限公司，批號為CFS201802）；鞣花酸（EA）對照品（大連美侖生物科技有限公司，批號為M0104AS）；蘆丁對照品（上海葉源生物科技有限公司，批號為Y24F11Y17051），含量均不小于98%；PPO 活性檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號為20210407）；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。余甘子果實（云南省臨滄市云縣新鮮采摘）。

2 方法與結(jié)果

2.1 水解單寧類成分含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～5 min 時5%B，5～6 min 時5%B→15%B，6～15 min 時15%B，15～25 min 時15%B→30%B；流速：1.0 mL/ min；檢測波長：270 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL。

2.1.2 溶液制備

分別取1 - GG，GA，TGG，EA 對照品2.31，2.07，0.68，2.00 mg，精密稱定，置10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并定容，即得混合對照品溶液。取樣品（去核）5 g，精密稱定，加適量石英砂研磨，盡量搗碎，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱至70 ℃回流1.5 h，稱定質(zhì)量，加50%甲醇補足減失的質(zhì)量；45 ℃超聲（功率240 W，頻率40 kHz，下同）1 h，放冷，再次稱定質(zhì)量，加50%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀70 ℃下蒸干，殘渣加甲醇溶解并定容至10 mL，經(jīng)0.45 μm 濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。以甲醇（分析純）為陰性對照品溶液。

2.1.3 方法學考察

系統(tǒng)適用性試驗：取混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各適量，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果理論板數(shù)按1-GG 峰計應不低于3 000；分離度均大于1.5，基線分離良好。見圖1。

1.1-GG 2.GA 3.TGG 4.EAA.混合對照品溶液 B.供試品溶液 C.陰性對照品溶液圖1 高效液相色譜圖1.1-GG 2.GA 3.TGG 4.EAA.Mixed reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：分別精密吸取2.1.2項下混合對照品溶液2，4，6，8，10，12 μL，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分進樣量（X，μg）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得1-GG，GA，TGG，EA的回歸方程分別為Y1= 2 282.2X1+ 3 791.1（R2=0.999 1），Y2= 1 636.1X2+ 17.098（R2= 0.999 2），Y3=3 459.6X3+ 52.813（R2= 0.999 3），Y4= 1 951.3X4+16.8（R2=1.000 0）。結(jié)果表明，1-GG，GA，TGG，EA進樣量分別在0.46～2.77 μg、0.41～2.48 μg、0.14～0.82 μg、0.40～2.40 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗：取2.1.2 項下混合對照品溶液適量，按擬訂色譜條件連續(xù)進樣測定6 次，記錄峰面積。結(jié) 果1 - GG，GA，TGG，EA 峰 面 積 的RSD分 別 為0.64%，0.22%，0.20%，0.25%（n= 6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取2.1.2 項下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，2，4，6，8，10 h 時按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果1 - GG，GA，TGG，EA峰面積的RSD分別為3.02%，3.17%，3.60%，1.81%（n= 6），表明供試品溶液在室溫放置10 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復性試驗：精密稱取同一批樣品適量，共6份，按2.1.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算含量。結(jié)果1 - GG，GA，TGG，EA 含 量 的RSD分 別 為0.36%，0.53%，2.49%，0.67%（n=6），表明方法重復性良好。

2.1.4 樣品中水解單寧類成分含量變化

1 - GG，GA，TGG，EA 分別在樣品貯藏第15 天、第15 天、第19 天、第20 天時含量最高，在貯藏第4 天、第19 天、第18 天、第18 天時含量最低。結(jié)果顯示，1 - GG及EA 在第2 天時含量增加，到第4 天含量減少，后呈曲線大幅波動；GA及TGG在前4天內(nèi)含量減少，后呈曲線小幅波動。詳見圖2。即5 ℃條件下，樣品中水解單寧類成分隨貯藏時間的延長，含量總體僅小幅變化。

2.2 黃酮類成分含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：0.1%磷酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～2 min 時，22%B，2～20 min 時22%B→60%B）；流速：0.8 mL/min；檢測波長：327 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.2.2 溶液制備

取蘆丁對照品0.80 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得蘆丁對照品溶液。取樣品（去核）5 g，精密稱定，加適量石英砂研磨，盡量搗碎，置具塞錐形瓶中。精密加入75%甲醇50 mL，45 ℃超聲1 h，放冷，稱定質(zhì)量，用75%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，濃縮，加甲醇定容至10 mL，經(jīng)0.45 μm 濾膜濾過，即得供試品溶液。

A.1 - GG B.GA C.TGG D.EA圖2 水解單寧類成分的含量變化A.1-GG B.GA C.TGG D.EAFig.2 Content change of hydrolyzed tannins

5.蘆丁A.對照品溶液 B.供試品溶液 C.陰性對照品溶液圖3 蘆丁的高效液相色譜圖5.RutinA.Mixed reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.3 HPLC chromatograms

2.2.3 方法學考察

系統(tǒng)適用性試驗：取上述對照品溶液、供試品溶液及2.1.2 項下陰性對照品溶液各適量，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果，理論板數(shù)按蘆丁峰計應不低于3 000；分離度均大于1.5，基線分離良好。詳見圖3。

線性關(guān)系考察：分別精密吸取2.2.2 項下蘆丁對照品溶液2，4，6，8，10，12 μL，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以蘆丁進樣量（X，μg）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得蘆丁的回歸方程為Y= 1 448X- 0.72（R2= 0.999 6）。結(jié)果表明，蘆丁進樣量在0.16～0.94 μg 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗：取2.2.2 項下蘆丁對照品溶液適量，按2.2.1 項下色譜條件連續(xù)進樣測定6 次，記錄峰面積。結(jié)果蘆丁峰面積的RSD為0.28%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取2.2.2 項下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，2，4，6，8，10 h 時按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果蘆丁峰面積的RSD為3.92 %（n= 6），表明供試品溶液在室溫放置10 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復性試驗：稱取同一批樣品適量，精密稱定，共6 份，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算含量。結(jié)果蘆丁含量的RSD為0.24%（n= 6），表明方法重復性良好。

2.2.4 樣品中蘆丁含量變化

樣品中蘆丁含量在第10 天達到最高，第4 天含量最低，前4天內(nèi)蘆丁含量逐漸下降，后呈曲線波動，整體波動幅度較小。結(jié)果表明，黃酮類成分（蘆丁）在5 ℃條件下貯藏，含量變化在一定范圍內(nèi)。詳見圖4。

圖4 黃酮類成分（蘆丁）含量變化Fig.4 Content change of flavones（rutin）

2.3 PPO 活性測定

取樣品（去核）0.1 g，精密稱定，置2 mL EP管中，加1 mL 提取液，冰浴搗碎，4 ℃下、8 000g離心10 min，取上清液250 μL，于常溫水浴10 min，后迅速放入沸水水浴10 min，放冷，4 ℃下、5 000g離心10 min。加入試劑一600 μL，試劑二150 μL，提取液150 μL。混勻，設置6 個復孔，每孔100 μL，磷酸鹽緩沖液（PBS）封邊，置96 孔板。于410 nm 波長處測定其吸光度（A），并計算PPO的活性，以反應液作對照，1 d測定1次。PPO活性計算公式，PPO=（A測定-A對照）×60/0.1。結(jié)果顯示，PPO活性在第14 天時最高，第1 天時最低，整體呈曲線波動。詳見圖5 A。

2.4 褐變指數(shù)測定

將樣品果心的中心部位橫切，按橫切面上果肉組織相應的褐變程度和面積來劃分等級［11］。無褐變?yōu)?級，果肉褐變面積≤25%為1 級，> 25%～50%為3 級，> 50%～< 75%為3 級，≥75%為4 級，每次統(tǒng)計10 個果實。每次統(tǒng)計10 個樣品。余甘子褐變指數(shù)計算公式，褐變指數(shù)= ∑（褐變級別× 級別果實數(shù)）/ 最高級別數(shù)×統(tǒng)計果實數(shù)（注：褐變指數(shù)為1時，可表示為完全褐變）。余甘子的褐變指數(shù)在第9 天和第10 天時達到最高，在第1天時最低，其變化呈曲線波動。但隨著時間延長，褐變指數(shù)呈升高趨勢，表明5 ℃貯藏條件下，樣品出現(xiàn)了輕微褐變。詳見圖5 B。

A.PPO活性 B.褐變指數(shù) C.pH圖5 PPO活性、褐變指數(shù)及pH變化A.PPO activity B.Browning index C.pHFig.5 Changes of PPO activity，browning indexes and pH

2.5 pH 測定

取樣品（去核）10 g，精密稱定，加適量石英砂研勻，置三角瓶中，加20 mL 水，80 ℃下水浴30 min，冷卻濾過，取續(xù)濾液，用pH計測定pH。pH在第10天時達最大，總體呈先上升后下降的波動趨勢。詳見圖5 C。

3 討論

通常認為，影響中藥鮮品褐變的外界因素包括溫度、濕度、貯藏時間等，中藥自身的物質(zhì)也會影響褐變的發(fā)生。余甘子果實所含化學成分較豐富，藥理活性較多，故對其褐變進行有效抑制尤為重要。有研究表明，新鮮余甘子果實褐變多與酚類物質(zhì)有關(guān)，水解單寧能在酸性、堿性條件下水解產(chǎn)生沒食子酸、PGG 等中間產(chǎn)物［12-13］。沒食子酸作為褐變的底物，可與PPO 反應氧化為醌和水，醌再經(jīng)酶促或非酶促氧化聚合，形成褐色物質(zhì)，而產(chǎn)生褐變［14］。新鮮余甘子果實中含有的黃酮類化合物綠原酸、蘆丁在酶的催化下形成醌類物質(zhì)，最終也形成不溶性的褐色多酚—— 黑色素，使其發(fā)生褐變［15］。新鮮余甘子果實的貯藏及運輸，極易影響其藥效及質(zhì)量，但誘發(fā)其褐變的因素及機制尚未明確。

此外，新鮮余甘子果實在5 ℃下貯藏20 d 過程中，樣品存在一定的個體差異，所測結(jié)果呈現(xiàn)的貯藏過程中與褐變相關(guān)的各指標的變化趨勢較平穩(wěn)。

本研究結(jié)果表明，新鮮余甘子果實在5 ℃下貯藏20 d 的過程中，酚類化合物的含量、PPO 活性和褐變指數(shù)呈曲線波動，其有效成分含量未出現(xiàn)明顯變化，pH呈先升后降的波動趨勢，表明5 ℃可作為新鮮余甘子果實的最佳貯藏條件。