氣相色譜串聯質譜法檢測替格瑞洛原料藥中N-亞硝胺類雜質*

朱 婧，徐海燕△，朱躍芳，趙靜芝，譚鑫強

（1.沈陽藥科大學，遼寧 沈陽 110000； 2.湖南省株洲市食品藥品檢驗所，湖南 株洲 412000； 3.株洲千金藥業股份有限公司，湖南 株洲 412000）

N-亞硝胺類化合物屬遺傳毒性雜質，進入人體可立即通過細胞色素P450 酶代謝活化，生成活性烷基及小分子醛，與DNA 和蛋白質結合，進而破壞DNA 的復制及損傷蛋白質結構等［1-2］，在痕量水平即可造成DNA 和染色體損傷。故此類化合物屬國際人用藥品注冊技術協調會（ICH）M7（R1）（《評估和控制藥物中DNA反應性（致突變）雜質以限制潛在致癌風險》）指南［3］中提及的“關注隊列”物質。且根據世界衛生組織（WHO）公布的致癌物清單［3］，N-亞硝基二甲胺（NDMA）和N-亞硝基二乙胺（NDEA）均屬2A 類致癌物質。此外中國藥典委員會、美國食品藥物管理局（FDA）、歐洲藥品質量管理局（EDQM）已發布了氣相色譜串聯質譜（GC -MS/MS）法、液相色譜串聯質譜（LC-MS/MS）法等多種檢測方法，以檢測沙坦類藥物中N- 亞硝胺類雜質［4-14］。替格瑞洛為環戊基三唑嘧啶類新型口服抗血小板藥物，于2010 年12 月在歐洲上市，用于急性冠狀動脈綜合征（ACS）的治療［15］。其主要經縮合反應、環合反應、取代反應、脫異丙基反應合成［16］。替格瑞洛的起始物料合成過程中使用N，N-二異丙基乙胺（DIPEA），可能含有二甲胺、二乙胺和二異丙基乙胺，在環合反應時使用亞硝酸鈉/乙酸條件進行重氮化環化反應，故可能產生N- 亞硝胺類雜質［17］，如N -亞硝基二異丙胺（NDIPA）、NDMA和NDEA。為了保證藥品的安全和質量可控，本研究中參照2020 年版《中國藥典（四部）》通則9306“遺傳毒性雜質研究指導原則”［18］，采用GC-MS/MS法檢測替格瑞洛中N-亞硝胺類雜質。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

8890型氣相色譜儀、7010B型三重四極桿質譜檢測器（美國Agilent 公司）；MS105DU 型電子分析天平（精度為0.01 mg）及ME204/ 02 型電子分析天平（精度為0.1 mg），均購于梅特勒-托利多國際貿易有限公司。

1.2 試藥

NDMA標準溶液（德國Dr.Ehrenstorfer公司，批號為985092ME，質量濃度100 μg/mL）；NDEA 對照品（美國Cato Research Chemicals Inc.，批號為0325-RA-0011，含量97.8%）；NDIPA對照品（上海啟泰生物科技有限公司，批號為19082291，含量95.35%）；氘代N-亞硝基二甲胺（NDMA-d6）標準溶液（北京曼哈格生物科技有限公司，批號為14658-034，質量濃度為100 μg/mL）；甲醇（美國Spectrum 公司，HPLC 級，批號為3TB0010）；替格瑞洛（原料藥，批號分別為20200801，20200901，20200902，2020903，2020904；粗 品，批 號 分 別 為20200701，20200801，20200901，20200902，20200903；均購自湖南千金湘江藥業股份有限公司）。

2 方法與結果

2.1 試驗條件

色譜條件：色譜柱為Agilent VF - WAXms 毛細管柱（30 m × 0.25 mm，1.0 μm），程序升溫（初始柱溫為40 ℃，保持0.5 min，以20 ℃/min的速率升至200 ℃，再以60 ℃/min的速率升至230 ℃，保持8 min），進樣口溫度為250 ℃，載氣為高純氦氣，流速為1.0 mL/ min，進樣方式為不分流，進樣量為1 μL。

質譜條件：離子源為電子轟擊離子源（EI），溶劑延遲7 min；電壓為70 eV，離子源溫度為250 ℃；多反應監測模式（MRM），檢測定量離子質荷比（m/z）為130→88（NDIPA），74→44（NDMA），102→85（NDEA），檢測定性離子m/z為130→42（NDIPA），74→42（NDMA），102→56（NDEA）。

2.2 溶液制備

內標溶液：精密量取NDMA-d6標準溶液50 μL，置500 mL容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，即得。

混合對照品溶液：取NDIPA 和NDEA 對照品各約15 mg，精密稱定，分別置50 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，分別作為NDIPA 和NDEA 對照品貯備液。各精密量取1 mL，置同一100 mL 容量瓶中，用內標溶液定容，即得NDIPA 和NDEA 對照品溶液；分別精密量取1 mL，與NDMA 標準溶液0.1 mL 置同一50 mL 容量瓶中，用內標溶液定容，搖勻，即得NDIPA，NDMA，NDEA混合對照品貯備液。精密量取1 mL，置20 mL容量瓶，用內標溶液定容，搖勻，即得。

供試品溶液：取替格瑞洛約400 mg，精密稱定，置20 mL容量瓶中，加內標溶液溶解并定容，搖勻。

2.3 方法學考察

專屬性試驗：取2.2 項下內標溶液、混合對照品溶液，按2.1項下試驗條件進樣測定，記錄色譜圖。結果見圖1和圖2，表明內標溶液不干擾NDMA，NDEA，NDIPA的檢測。

1.NDMA 2.NDEA 3.NDIPAA.內標溶液 B.混合對照品溶液圖1 總離子流圖1.NDMA 2.NDEA 3.NDIPAA.Internal standard solution B.Mixed reference solutionFig.1 Total ion flow chromatograms

線性關系考察及定量限與檢測限確定：將混合對照品貯備液用內標溶液稀釋，得NDMA 質量濃度分別為2.09，5.22，10.44，15.66，20.88 ng/mL，NDEA 質量濃度為0.61，1.54，3.07，4.61，6.14 ng/ mL，NDIPA 質量濃度為0.58，1.46，2.91，4.37，5.83 ng/ mL 的系列混合對照品溶液，按2.1 項下試驗條件進樣測定，以待測成分質量濃度（X）為橫坐標、NDMA，NDEA，NDIPA與內標物峰面積比值為縱坐標（Y）進行線性回歸，結果見表1。取混合對照品溶液（NDMA 2.09 ng/mL，NDEA 0.61 ng/ mL，NDIPA 0.58 ng/ mL），按2.1 項下試驗條件進樣測定，以信噪比分別為10∶1，3∶1 時的含量計作定量限和檢測限，結果見表1。

表1 線性關系考察及定量限和檢測限結果（n=5）Tab.1 Results of linear relation test，LOQ and LOD（n=5）

A.NDMA-d6 B.NDMA C.NDEA D.NDIPA圖2 MRM色譜圖A.NDMA - d6 B.NDMA C.NDEA D.NDIPAFig.2 MRM chromatograms

精密度試驗：取2.2項下混合對照品溶液，按2.1項下試驗條件1 d內連續進樣6次或連續進樣3 d、1 d 1次，測定，記錄峰面積。結果日內精密度中NDMA，NDEA，NDIPA 與內標物峰面積比值的RSD分別為2.10%，1.48%和1.48%（n=6），均小于5%，表明儀器精密度良好。日間精密度中NDMA，NDEA，NDIPA 與內標物峰面積比值的RSD分別為3.17%，1.83%和1.42%，均小于5%，表明日間精密度符合要求。

穩定性試驗：取混合對照品溶液，室溫放置0，8，19 h 時，按2.1 項下試驗條件進樣測定，記錄峰面積。結果，NDMA，NDEA，NDIPA 與內標物峰面積比值的RSD分別為1.14%，2.72%，1.03%（n=3），表明供試品溶液在室溫下放置19 h內穩定性良好。

重復性試驗：取樣品約400 mg，精密稱定，各6份，按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1 項下試驗條件進樣測定，記錄峰面積。結果NDMA，NDEA，NDIPA 與內標物峰面積比值的RSD分別為3.62%，1.46%，1.48%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取樣品約400 mg，精密稱定，共9份，分別加入混合對照品貯備液0.5，1，1.5 mL，按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1 項下色譜條件進樣測定。結果見表2。

表2 加樣回收試驗結果（n=9）Tab.2 Results of the recovery test（n=9）

2.4 樣品檢測

取多批次替格瑞洛粗品及對應批次的原料藥，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下試驗條件進樣測定。結果均未檢出這3種亞硝胺類雜質。

3 討論

3.1 色譜條件選擇

替格瑞洛中亞硝胺類雜質NDMA，NDEA 和NDIPA檢測方法主要依據2019 年4 月FDA 公布的檢測方法及文獻資料［19-21］制訂，根據雜質限度和主成分理化性質，為保證方法專屬性，將供試品溶液質量濃度降低至20 mg/ mL，不僅減小了背景噪音，也大大降低了由樣品量過大導致主成分在系統殘留的風險，延長了燈絲和色譜柱的使用壽命。

N-亞硝胺類為極性化合物，VF-WAXms毛細管色譜柱（30 mm×0.25 m，1.0 μm）適用于極性化合物，使各雜質在較短的時間內實現良好分離，且柱流失較低，具有較低的背景噪聲，故確定使用此色譜柱進行后續研究。

3.2 質譜條件選擇

質譜條件也參考2019 年4 月FDA 公布的NDIPA，NDMA 和NDEA 檢測方法［19-21］制訂，配制質量濃度為2 ng/mL的線性溶液，通過比較-40，70 eV電子轟擊離子源電壓，響應值無明顯差異，且70 eV 為常用電子轟擊離子源電壓，因此采用70 eV。

配制質量濃度為2 ng/ mL 的線性溶液，對進樣方式進行研究，結果顯示，與一般直接進樣相比，采用脈沖不分流，可減少不穩定待測物在進樣口分解的機會，且樣品集中進入色譜柱可提高檢測的靈敏度。

3.3 樣品測定結果分析

亞硝胺類雜質致癌風險高，FDA網站公布的NDIPA、NDMA、NDEA 的臨時每日可接受攝入量（AI）分別為26.5，96，26.5 ng/ d［22］，根據替格瑞洛最大日劑量為180 mg，計算其限度（限度= AI/ 每日用藥量）分別為0.147，0.533，0.147 μg/ g。檢測多批次粗品及相對應批次成品，3 種亞硝胺類雜質均未檢出，表明此合成工藝對該類雜質清除效果較好。此外，由于在不同工藝步驟中分別使用能引入仲胺和亞硝化試劑的物料，產生亞硝胺類雜質的可能性本身極低，結合檢測數據，質量控制風險較小。

綜上所述，本試驗中采用LC-MS/MS法測定替格瑞洛中N-亞硝胺類雜質，方法專屬性強，靈敏度高，基質干擾小，適用于實驗室中藥物基因毒性雜質的日常檢測。