鹽酸西替利嗪脂質體凝膠的制備及初步藥理學研究*

徐曉玲，黃雪峰，蕭偉斌，姜志輝，王興旺，王 冰，袁 進，△

（1.南方醫科大學藥學院，廣東 廣州 510515； 2.中國人民解放軍南部戰區總醫院，廣東 廣州 510010）

因脫發帶來的精神壓力，可對人們的生活產生嚴重負面影響，因此改善脫發的需求激增［1］。雄激素性脫發（AGA）是最常見脫發類型［2］，指南推薦男性口服非那雄胺和外用米諾地爾，女性口服環丙孕酮、螺內酯和外用米諾地爾，但AGA 治療周期長，患者用藥依從性差。長期使用口服藥物會引起嚴重的藥品不良反應，如螺內酯可致電解質紊亂、性欲降低；植發費用高昂且為有創手術；外用米諾地爾為油性藥物、不易清洗，女性患者使用后出現局部多毛等表現［3］。故尋找新的藥物作用靶點成為當前AGA 治療的熱點。鹽酸西替利嗪屬第2代組胺（H1）受體選擇性拮抗劑，為臨床常用且安全的抗過敏藥物［4］。國外多項研究報道，局部使用西替利嗪乙醇溶液治療AGA療效良好［5-6］。但乙醇溶液劑對皮膚刺激性較強，且難透過頭皮角質層，降低了西替利嗪的潛在療效［7］。本研究中針對乙醇溶液劑的缺點，制備了一種新型且使用方便、安全無毒、具有皮膚靶向作用的鹽酸西替利嗪脂質體凝膠劑。現報道如下。

1 儀器、試藥與動物

1.1 儀器

Agilent 1100型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；RV10型旋轉蒸發儀（德國IKA公司）；BP211D型分析天平（上海精科天平有限公司）；SHZ-DⅢ型循環水式真空泵（湖南省予華儀器有限公司）；H-2050R 型高速離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；KPQ - 1200 型超聲清洗儀（廣州市科普超聲電子技術有限公司）、PHS-3C 型pH 計（上海儀電科學儀器股份有限公司）；Zetasizer Nano ZS 型粒徑分析儀（英國Malvern 儀器公司）；H-7650型透射電子顯微鏡（日本Hitachi公司）。

1.2 試藥

鹽酸西替利嗪原料藥（批號為C805576，規格為25 g，含量98%），卡波姆-940（批號為S31102，規格為250 g），均購自上海麥克林生化科技有限公司；鹽酸西替利嗪對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為6HVN -XRT2，規格為100 mg，含量99.6%）；米諾地爾酊（商品名蔓迪，浙江萬晟藥業有限公司，規格為60 mL）；磷酸鹽 緩沖 液（PBS，美國Gibco 公 司，規 格 為500 mL，pH7.4）；大豆卵磷脂（批號為S30869，卵磷脂含量≥10%）、膽固醇（批號為S11040，含量95%），規格均為100 g，均購自上海源葉生物科技有限公司；甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 動物

SPF 級雄性C57BL/ 6 小鼠24 只，購自廣東省醫學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號SCXK（粵）2018-0002。實驗期間小鼠飼養于溫度（25 ± 1）℃、相對濕度（50±5）%環境中，并進行適應性喂養。實驗動物使用經醫院動物中心倫理學管理委員會批準。

2 方法與結果

2.1 脂質體含量、包封率及載藥量測定

2.1.1 含量測定

色譜條件：色譜柱為Waters Symmetry?C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-水（40∶60，V/V）；流速為1.0 mL/ min；檢測波長為232.11 nm；柱溫為25 ℃；進樣量為20 μL。

溶液制備：取鹽酸西替利嗪對照品適量，加流動相溶解，制成對照品溶液。取大豆卵磷脂及膽固醇適量，置茄形瓶中，加10 mL 氯仿溶解并定容，于50 ℃水浴條件下減壓旋轉蒸發10 min 得藥膜，將含一定量鹽酸西替利嗪的PBS 加入藥膜中，水浴中磁力攪拌水化，冷卻至室溫，超聲（功率1 200 W，頻率40 kHz，下同）處理5 min，經0.45 μm 濾膜擠壓濾過，即得鹽酸西替利嗪脂質體溶液［8］。

方法學考察：以鹽酸西替利嗪質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y= 34.21X+ 25.85（R2= 0.999 6，n=5）。結果表明，鹽酸西替利嗪質量濃度在5.0～100.0 μg/mL 范圍內與峰面積線性關系良好；精密度、穩定性、重復性試驗結果的RSD均小于1.0%；平均加樣回收率為98.20%，RSD為0.81%（n=6）。

2.1.2 包封率及載藥量測定

精密吸取鹽酸西替利嗪脂質體溶液100 μL，加甲醇900 μL，渦旋5 min，超聲處理5 min，12 000 r/min 離心30 min，精密吸取上清液20 μL 進樣，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，得所制備脂質體中包封藥物的總含量W2；精密吸取鹽酸西替利嗪脂質體溶液1 000 μL，12 000 r/min 離心30 min，取上清液100 μL，加甲醇定容至1 000 μL，渦旋5 min，取20 μL 進樣，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，得所制備脂質體中包封藥物的游離藥含量W1。包封率（%）=（W2-W1）/W2×100%；載藥量（%）=（W2-W1）/W3× 100%（W3為材料總質量和藥物總質量之和）［9］。

A.大豆卵磷脂與膽固醇的質量比 B.鹽酸西替利嗪用量 C.水化溫度 D.水化時間 E.PBS用量圖1 單因素試驗結果A.Mass ratio of soybean lecithin to cholesterol B.Dosage of cetirizine hydrochloride C.Temperature of hydration D.Time of hydration E.Dosage of PBSFig.1 Results of the single factor test

2.2 脂質體處方優化

2.2.1 單因素試驗

以包封率為考察指標，大豆卵磷脂與膽固醇的質量比（簡稱質量比，1=50 mg）、鹽酸西替利嗪用量（簡稱用量）、水化時間、水化溫度及PBS 用量為考察因素，采用單因素試驗初步確定因素范圍，結果見圖1。可見，包封率并未因水化溫度的升高而產生明顯變化，故后續試驗選定水化溫度為50 ℃。

2.2.2 正交試驗

以質量比（因素A）、用量（因素B）、水化時間（因素C）、PBS 用量（因素D）為考察因素，以包封率為考察指標，采用L9（34）正交試驗法優選鹽酸西替利嗪脂質體制備工藝。因素與水平見表1。

表1 因素與水平表Tab.1 Factors and their levels

正交試驗結果見表2，方差分析結果見表3。可見，因素B，C，D 對包封率均有顯著影響（P< 0.05），各因素對包封率影響強度為C > D > B > A，最佳處方及最佳制備工藝為A1B2C1D1，即大豆卵磷脂250 mg，膽固醇50 mg，鹽酸西替利嗪25 mg，PBS 5 mL，水化溫度50 ℃，水化0.5 h。

表2 L9（34）正交試驗設計及結果（n=9）Tab.2 Design and results of the L9（34）orthogonal test（n=9）

表3 方差分析結果Tab.3 Results of the ANOVA

2.2.3 驗證試驗

按最優處方及最佳制備工藝，平行制備3批鹽酸西替利嗪脂質體樣品，按2.1.2項下方法計算包封率及載藥量。結果見表4，表明該制備工藝簡單合理，結果穩定可靠。

表4 鹽酸西替利嗪脂質體重現性考察（%，n=3）Tab.4 Results of the reproducibility test of cetirizine hydrochloride liposomes（%，n=3）

2.3 脂質體理化性質考察

2.3.1 微觀形態

取按最佳制備工藝制備的鹽酸西替利嗪脂質體溶液適量，滴加在銅片上，用1%磷鎢酸鈉溶液負染并晾干，采用透射電子顯微鏡（TEM）觀察。結果見圖2。可見，脂質體均勻分布，表面光滑，外觀形態圓整，且可觀察到明顯的磷脂雙分子層結構。

圖2 鹽酸西替利嗪脂質體電鏡圖Fig.2 Electron microscope image of cetirizine hydrochloride liposomes

2.3.2 粒徑及Zeta 電位測定

取按最佳制備工藝制備的鹽酸西替利嗪脂質體溶液適量，倍比稀釋，采用Zetasizer Nano ZS 型粒徑分析儀測定脂質體粒徑及Zeta 電位。結果脂質體粒徑為（174.6±1.2）nm，多分散系數為0.263±0.013，Zeta 電位為（-43.2±1.6）mV。結果見圖3。

A.粒徑分布 B.電位分布圖3 鹽酸西替利嗪脂質體粒徑及電位分布圖A.Particle size distribution B.Potential distributionFig.3 Particle size and potential distribution of cetirizine hydrochloride liposomes

2.4 脂質體凝膠

2.4.1 制備

稱取5 g 4%空白凝膠基質，置燒杯中，加按最佳制備工藝制備的鹽酸西替利嗪脂質體溶液10 mL，加甘油2 g，再加尼泊金乙酯（防腐劑）16 mg，加蒸餾水定量至20 g，攪拌均勻，加適量三乙醇胺調pH 及稠度，攪拌均勻，即得鹽酸西替利嗪脂質體凝膠。

2.4.2 穩定性

性狀考察：取3 批鹽酸西替利嗪脂質體凝膠各適量，觀察外觀，發現本品為淡黃色半透明狀半固體制劑，細膩均勻，且無成團顆粒。

凝膠pH：取3 批鹽酸西替利嗪脂質體凝膠各1 g，加水20 mL，攪拌均勻，使用pH 計測pH，發現本品pH為6.5，較穩定，且對人體皮膚刺激性小。

離心試驗：取3 批鹽酸西替利嗪脂質體凝膠各1 g，置2 mL 離心管中，3 500 r/ min 離心30 min，發現本品離心后均外觀均勻，無分層或凝聚現象。

溫度試驗：取3 批鹽酸西替利嗪脂質體凝膠劑各適量，分別于- 20 ℃放置48 h、25 ℃放置48 h 及60 ℃放置6 h 后，發現本品均無凝固或分層現象，性質較穩定。

穩定性試驗結果見圖4。

2.5 藥效學考察

2.5.1 材料與方法

模型復制：小鼠背部固定部位剃毛，用脫毛膏除盡殘余絨毛，面積約為2 cm×2 cm。

分組與給藥：將24 只小鼠隨機分為空白對照組（等體積生理鹽水）、陽性對照組（5%米諾地爾酊，1 mL/次）和實驗組（鹽酸西替利嗪脂質體凝膠，1 g/次），各8只。各組小鼠脫毛24 h后開始涂相應藥物或生理鹽水，每日1次，連續18 d。

觀察指標：實驗過程中，觀察小鼠背部脫毛部位皮膚顏色變化及毛發生長情況，并于給藥后第4，6，10，13 d拍照；給藥過程中，密切觀察小鼠給藥部位皮膚是否出現紅腫、水皰或潰爛等接觸性皮炎癥狀；觀察小鼠生活習性等方面的改變。

2.5.2 統計學處理

采用GraphPad Prism 8 統計學軟件分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey 檢驗。檢驗水準α=0.05，P<0.05為差異有統計學意義。

2.5.3 實驗結果

連續給藥5～6 d 后，實驗組小鼠開始出現較明顯的灰色皮膚，陽性對照組小鼠出現散落的淺灰色斑塊，空白對照組小鼠僅局部出現較淺灰色皮膚；連續涂藥10 d 后，實驗組小鼠皮膚接近全部變灰且有較多絨毛長出，陽性對照組小鼠背部皮膚也接近全變灰及有絨毛生長，空白對照組小鼠背部出現灰色皮膚但不均勻，未見絨毛長出。給藥過程中，小鼠均未出現紅腫、水皰或潰爛等接觸性皮炎癥狀。結果見表5及圖5。

表5 小鼠皮膚顏色及生長變化時間（±s，d，n=8）Tab.5 Time of skin color change and growth in mice（±s，d，n=8）

表5 小鼠皮膚顏色及生長變化時間（±s，d，n=8）Tab.5 Time of skin color change and growth in mice（±s，d，n=8）

注：與空白對照組比較，#P < 0.05。Note：Compared with those in the blank control group，#P < 0.05.

組別空白對照組陽性對照組實驗組皮膚變灰6.875±0.354 6.125±0.991 5.000±1.069#毛發初長10.625±0.744 10.250±1.165 8.625±1.302#

A.溫度試驗 B.性狀考察 C.離心試驗圖4 鹽酸西替利嗪脂質體凝膠穩定性試驗結果A.Temperature test B.Character investigation C.Centrifugal testFig.4 Results of the stability test of cetirizine hydrochloride liposomes

3 討論

脂質體因為結構多樣性、生物相容性、生物降解性、無毒性和無免疫原性而被廣大科研人員用作藥物傳遞系統。鹽酸西替利嗪水溶性好而脂溶性差，較難透過皮膚屏障，將其制備成脂質體，可利用脂質體良好的透皮特性［10］，促進藥物吸收，在皮膚表層形成藥物儲存庫，穩定釋放藥物，提高療效。包封率是脂質體質量控制的一個重要指標，脂質體包封率越大，越易滿足臨床需要。故本研究中以包封率為考察指標，采用薄膜分散法制備鹽酸西替利嗪脂質體，通過高速離心法測定脂質體的包封率，其操作簡便且準確率高［11］。

A.實驗組 B.陽性對照組 C.空白對照組圖5 小鼠皮膚顏色及毛發變化A.Experimental group B.Positive control group C.Blank control groupFig.5 Change plot of mice′s skin color and hair

對制備工藝的處方進行優化，是提高脂質體質量的關鍵步驟，影響制劑質量的各個因素是相互作用的，故制劑的最優制備工藝并不是最佳單因素的簡單組合。本研究中通過單因素試驗確定了大豆卵磷脂與膽固醇的質量比、鹽酸西替利嗪用量、水化時間和PBS 用量這4個因素對脂質體包封率影響較大的范圍，后以正交試驗法考察各因素相互作用下對脂質體包封率的影響，最后得到理想的處方，且該處方工藝經驗證制備得到的脂質體質量穩定。

用于醫療用途的脂質體粒徑為50～450 nm［12］，本研究中制備的脂質體粒徑為（174.6 ± 1.2）nm，符合要求。有研究表明，1 個50～250 nm 脂質雙分子層包裹了1 個大的水核，非常適用于包裹親水性藥物［13］，鹽酸西替利嗪為水溶性藥物，且透射電鏡觀察到其脂質體中心呈陰影狀，說明藥物被較好地包裹在了脂質體水核層中，可穿透頭皮角質層到達作用部位，從而提高了藥物的生物利用度。脂質體通過表面電荷的作用可較好地分散在體系中，防止其聚集和絮凝，使其處于穩定狀態，且組織學研究顯示，帶負電荷的脂質體通過角質層和毛囊擴散到真皮和毛囊下部的速率比陽性囊泡快［14］。因此，本研究中測得，帶負電荷的鹽酸西替利嗪脂質體的快速滲透有助于藥物快速到達皮膚毛囊部位，從而發揮療效。且透射電鏡下測得的粒徑平均值與粒度儀測得的粒徑值接近，說明以優化處方制備的脂質體重現性好且穩定性高。

由于脂質體難以附著在皮膚表層，而凝膠制劑與皮膚接觸時，可將皮膚表層迅速潤濕，藥物得以擴散并透過表皮［15］。因此將鹽酸西替利嗪脂質體與凝膠相結合制備出用于治療AGA 的鹽酸西替利嗪脂質體凝膠新型制劑，本研究中處方選用卡波姆-940 為凝膠基質，所得鹽酸西替利嗪脂質體凝膠質地清爽易涂抹。脂質體凝膠的用藥形式保證了藥物在皮層的保留量及保留時間［16-17］，且局部經皮給藥可避免口服用藥過程中的首過效應，從而提高藥物的生物利用度。且該凝膠pH 為6.5，與皮膚表面的pH 接近，降低了經皮制劑對皮膚的刺激性，提高了用藥依從性。

藥效研究中，選用C57BL/6小鼠復制脫發模型。此類小鼠毛發處于休止期時皮膚呈粉紅色，毛發進入生長期時黑色素在皮層沉淀皮膚呈灰色，故可通過其皮膚顏色的變化推斷出毛發所處的生長周期［18-19］。本研究結果表明，鹽酸西替利嗪脂質體凝膠對C57BL/ 6小鼠表現出明顯的毛發生長促進作用，可縮短小鼠背部毛發由休止期進入生長期的時間，且與目前市面上治療脫發的推薦用藥米諾地爾酊相比，能以較低的載藥量在更短時間內使毛發由休止期進入生長期。說明與酒精搽劑比較，脂質體凝膠表現出較好的生物利用度，且用藥量更小，可降低藥物的毒副作用，表現出明顯的用藥優勢，為脫發的臨床治療提供了更多選擇。

綜上所述，鹽酸西替利嗪作為臨床使用較成熟的抗組胺藥物，安全性較高，開發其新療效，擴大老藥適應證，可實現更多的藥用價值。本研究為鹽酸西替利嗪新劑型的開發提供了依據，也為AGA 的臨床藥物治療提供了更多選擇。在此基礎上，可進一步考察該脂質體凝膠的透皮吸收效果、藥物代謝動力學特點及治療雄激素脫發的具體作用機制，為新型藥物的臨床應用提供更完善的依據。