潰瘍性結(jié)腸炎中B細(xì)胞對(duì)巨噬細(xì)胞趨化作用的初步研究

張興華 邢 潔 孫 燦 張 希 王擁軍

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院消化內(nèi)科 國(guó)家消化系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心消化分中心，北京 100050)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)系由多種免疫細(xì)胞參與的腸道自身免疫性疾病。結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌(colitis-associated cancer，CAC)是結(jié)直腸癌的一種亞型，與潰瘍性結(jié)腸炎密切相關(guān)。流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)結(jié)果[1]證明，超過(guò)20%的潰瘍性結(jié)腸炎患者在未來(lái)30年內(nèi)會(huì)發(fā)展成為CAC，治療難度和病死率均高于散發(fā)性結(jié)腸癌。臨床及基礎(chǔ)研究[2-4]表明，潰瘍結(jié)腸炎腸道炎癥環(huán)境至少由巨噬細(xì)胞、髓樣來(lái)源抑制細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)、樹(shù)突狀細(xì)胞、T/B淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞、自然殺傷 T 細(xì)胞(natural killer T cells, NKT)以及自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NK)等免疫細(xì)胞參與。各類型免疫細(xì)胞與上皮細(xì)胞以及免疫細(xì)胞之間相互調(diào)控及反饋機(jī)制復(fù)雜多樣，形成了龐大的免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，因而目前尚有諸多問(wèn)題處于探索階段。本研究將利用經(jīng)典氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸鈉(azoxy-methane/dextran sodium sulpate,AOM/DSS)小鼠CAC模型作為研究對(duì)象，對(duì)B細(xì)胞與巨噬細(xì)胞的趨化作用機(jī)制進(jìn)行初步研究。

1 材料與方法

1.1 CAC小鼠模型誘導(dǎo)及分組

選擇18～20 g左右的雌性C57/BL6小鼠[購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，許可證號(hào)：SCXK(京)2018-0002]。腹腔注射AOM(購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)(劑量為 12.5 mg/kg)和口服3個(gè)過(guò)程的2.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))DSS(購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)。依照該疾病病程，分為正常對(duì)照組、第一程AOM/DSS組(AD1組)、第二程AOM/DSS組(AD2組)和第三程AOM/DSS組(AD3組)，每組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6只。

1.2 嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠(server combined immune-deficiency mice,SCID)小鼠免疫重建實(shí)驗(yàn)

選取T細(xì)胞及B細(xì)胞雙缺陷的SCID/Beige小鼠[購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，許可證號(hào)：SCXK(京)2018-0002]。作為研究對(duì)象，通過(guò)流式細(xì)胞分選法獲取正常C57/BL6野生型小鼠脾臟中的B細(xì)胞，于口服DSS第0天通過(guò)尾靜脈回輸給 SCID 小鼠。SCID小鼠的CAC誘導(dǎo)、各階段標(biāo)本的采集與野生型C57一致。

1.3 外周血及結(jié)腸組織中細(xì)胞比例的測(cè)定

外周血中免疫細(xì)胞比例的測(cè)定：采集不同病程的小鼠眼血，每組3～5只，通過(guò)Ficoll密度梯度離心法分別獲取小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMCs)。封閉非特異位點(diǎn)，加入熒光抗體，同時(shí)制備空白細(xì)胞管、同型對(duì)照管、實(shí)驗(yàn)組抗體管，于24 h內(nèi)完成流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)，所得數(shù)據(jù)用FlowJo軟件分析。

結(jié)腸組織中免疫細(xì)胞比例的測(cè)定：采集不同病程的小鼠結(jié)直腸組織，每組3～5只，通過(guò)膠原酶 A和DNase Ⅰ解離結(jié)腸組織，篩網(wǎng)過(guò)濾去除組織雜質(zhì)，重懸獲取單細(xì)胞懸浮液。封閉非特異位點(diǎn)，加入熒光抗體，同時(shí)制備空白細(xì)胞管、同型對(duì)照管、實(shí)驗(yàn)組抗體管，于24 h內(nèi)完成流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)，所得數(shù)據(jù)用FlowJo軟件分析。

1.4 組織免疫熒光共定位

石蠟包埋的白片先脫蠟和水化，熱修復(fù)法修復(fù)抗原，3%(體積分?jǐn)?shù))H2O2去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。封閉非特異位點(diǎn)，滴加一抗并孵育，清洗多余一抗，滴加熒光二抗并孵育。DAPI染色細(xì)胞核并孵育，去離子水沖洗多余染色液。使用 Invitrogen 抗淬滅熒光封片劑進(jìn)行封片，-20 ℃保存，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在野生型小鼠模型結(jié)腸組織中的變化趨勢(shì)

隨著CAC的疾病進(jìn)展，B細(xì)胞(CD19+B220+)在野生型小鼠結(jié)腸組織內(nèi)浸潤(rùn)比例逐漸增加，正常對(duì)照組、AD1組、AD2組和AD3組的比例分別為2.55%±0.14%、3.55%±0.25%、4.16%±0.21%和5.05%±0.17%，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=17.093 9，P=0.000)。巨噬細(xì)胞(CD11b+Gr-1-F4/80+)在野生型小鼠結(jié)腸組織內(nèi)浸潤(rùn)比例也呈逐漸增加趨勢(shì)，正常對(duì)照組、AD1組、AD2組和AD3組的比例分別為0.03%±0.01%、1.15%±0.11%、1.51%±0.14%和1.85%±0.13%，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=318.698，P=0.000)。詳見(jiàn)圖1。

圖1 在CAC疾病進(jìn)展各階段，B細(xì)胞及巨噬細(xì)胞在結(jié)腸組織中的浸潤(rùn)比例情況

2.2 免疫重建后巨噬細(xì)胞在SCID小鼠模型結(jié)腸組織中變化趨勢(shì)

分別予SCID小鼠免疫重建野生型B細(xì)胞后誘導(dǎo)CAC模型，通過(guò)流式細(xì)胞法分析小鼠結(jié)直腸組織中巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)情況。對(duì)照組(SCID-PBS)及回輸B細(xì)胞組(SCID-B)的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)比例分別為0.038%±0.014%和0.072%±0.015%(n=6，t=3.974，P=0.003)。詳見(jiàn)圖2。

圖2 免疫重建B細(xì)胞后巨噬細(xì)胞在SCID小鼠模型結(jié)腸組織中變化趨勢(shì)

2.3 單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP1/CCL2)的變化趨勢(shì)分析及與B細(xì)胞的共定位分析

利用流式細(xì)胞分選法獲取正常CD57/BL6小鼠及SCID病小鼠結(jié)直腸組織中的B細(xì)胞，通過(guò)real-time PCR法分析顯示，SCID小鼠B細(xì)胞的CCL2轉(zhuǎn)錄水平高于正常小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同時(shí)，通過(guò) CD20 熒光抗體標(biāo)記潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)直腸組織中的B細(xì)胞，發(fā)現(xiàn) CD20 與 CCL2 在結(jié)腸組織中有共定位現(xiàn)象。詳見(jiàn)圖3。

圖3 B細(xì)胞與CCL2變化趨勢(shì)圖

3 討論

多項(xiàng)研究[5-7]表明，潰瘍性結(jié)腸炎患者發(fā)病時(shí)間越長(zhǎng)，其結(jié)腸癌的患病率越高，10年發(fā)生結(jié)腸癌的概率為1.6%，20年結(jié)腸癌概率為8.3%，30年結(jié)腸癌概率為18.4%。因此，歐洲[8]和美國(guó)的指南[9]均建議病史大于 10 年的潰瘍性結(jié)腸炎患者每年需行針對(duì)結(jié)腸癌的內(nèi)鏡篩查。

巨噬細(xì)胞是一群異質(zhì)細(xì)胞，根據(jù)其功能和表型主要可分為 M1 型及 M2 型。目前的觀點(diǎn)[10]認(rèn)為，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞主要為M2型巨噬細(xì)胞，在腫瘤細(xì)胞及腫瘤微環(huán)境的誘導(dǎo)下，起源于骨髓的單核細(xì)胞可分化形成具有獨(dú)特表型的巨噬細(xì)胞。總結(jié)目前研究結(jié)果，巨噬細(xì)胞與腫瘤的關(guān)系主要體現(xiàn)為以下幾方面：①參與正常上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化：巨噬細(xì)胞可表達(dá)多種刺激腫瘤細(xì)胞增殖和存活的細(xì)胞因子，如上皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor, EGF)和血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet derived growth factor, PDGF)等，尤其是在結(jié)直腸癌和乳腺癌的形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用[5-6]。②介導(dǎo)細(xì)胞免疫抑制：M2型巨噬細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境下可導(dǎo)致細(xì)胞免疫低下，尤其是抑制T細(xì)胞和NK細(xì)胞的抗腫瘤活性[7]。③介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移：巨噬細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，可提高腫瘤細(xì)胞的腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)及基質(zhì)金屬蛋白酶依賴的侵襲特性。在腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的集落刺激因子的誘導(dǎo)下，巨噬細(xì)胞合成EGF，誘導(dǎo)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移及侵襲相關(guān)基因的表達(dá)水平上調(diào)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞在膠原基質(zhì)中的定向運(yùn)動(dòng)及侵襲活性。綜合以上三點(diǎn)，巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生發(fā)展的標(biāo)志性事件[11-13]。

經(jīng)典免疫學(xué)理論認(rèn)為，分布于腸道黏膜的 B 細(xì)胞主要為分泌IgM的B1細(xì)胞，其主要功能是參與機(jī)體的非特異性免疫反應(yīng)。B 細(xì)胞與潰瘍性結(jié)腸炎的關(guān)系研究相對(duì)較少，目前的研究[14]大多顯示結(jié)腸組織中B細(xì)胞的免疫球蛋白表達(dá)譜可能影響小鼠腸道共生菌群，并由此調(diào)控腸道炎癥水平。本課題組研究顯示，隨著潰瘍性結(jié)腸炎的進(jìn)展，B細(xì)胞在小鼠結(jié)腸的浸潤(rùn)比例逐漸升高，提示 B細(xì)胞可能參與了潰瘍性結(jié)腸炎的病程發(fā)展，該結(jié)論也在其他基礎(chǔ)及臨床研究[15]中得到了驗(yàn)證，但其機(jī)制尚未明確。

本研究顯示，以相同的潰瘍性結(jié)腸炎造模方法用于SCID小鼠，小鼠結(jié)腸組織內(nèi)未檢測(cè)到巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，而回輸野生型小鼠B 細(xì)胞后再次造模，結(jié)腸組織內(nèi)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)水平與野生型小鼠模型接近，該現(xiàn)象提示，在潰瘍性結(jié)腸炎病程中，B 細(xì)胞發(fā)揮了募集巨噬細(xì)胞到結(jié)直腸組織浸潤(rùn)的功能。

巨噬細(xì)胞來(lái)源于骨髓 CD34+的祖細(xì)胞，祖細(xì)胞通過(guò)分化形成前單核細(xì)胞釋放到外周血中進(jìn)一步分化成炎性單核細(xì)胞。游走于外周血的炎性單核細(xì)胞穿越血管壁到達(dá)結(jié)腸組織，在此過(guò)程中的遷移主要依靠趨化因子及其受體的作用。CCL2也被稱為單核細(xì)胞趨化蛋白-1，主要來(lái)源于內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、星狀膠質(zhì)細(xì)胞、平滑肌、上皮細(xì)胞、單核細(xì)胞及部分腫瘤細(xì)胞等，主要對(duì)表達(dá)CCR2、CCR4 及CCR10的細(xì)胞介導(dǎo)趨化作用，而其中最主要的靶點(diǎn)為CCR2。在多種炎癥模型中[16]，高水平炎癥因子會(huì)使得炎癥組織局部CCL2表達(dá)上調(diào)，更多的巨噬細(xì)胞被募集至炎癥組織加重局部炎癥水平，其中尤以TNF-α作用最強(qiáng)。在小鼠結(jié)腸癌模型中，野生型小鼠結(jié)腸癌組織內(nèi)有高水平的 TNF-α、CCL2 及巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，而當(dāng)敲除小鼠 TNF-α 表達(dá)后，結(jié)腸組織局部 CCL2 表達(dá)水平及巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)同時(shí)明顯降低[17]。基于以上研究，TNF-α 的靶向抗體英夫利昔單抗已被作為激素抵抗型潰瘍性結(jié)腸炎的一線治療方案寫(xiě)入臨床指南[9]。其可通過(guò)與單核細(xì)胞表面的相應(yīng)受體，即CCR2結(jié)合，促進(jìn)骨髓以及外周血中的單核細(xì)胞募集到結(jié)腸組織。CCR2 基因敲除的結(jié)腸炎小鼠不再會(huì)發(fā)生結(jié)腸癌，同時(shí)用 CCL2 封閉抗體治療野生型結(jié)腸炎小鼠，小鼠惡性轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)也明顯得到了控制，其機(jī)制可能與巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)降低相關(guān)[18]。2016 年的一項(xiàng)臨床研究[19]表明，結(jié)腸癌患者結(jié)腸組織內(nèi) CCL2 的表達(dá)水平與患者的不良預(yù)后呈正相關(guān)。本研究利用免疫熒光抗體檢測(cè)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的CCL2來(lái)源，發(fā)現(xiàn)CCL2與B細(xì)胞特異表面抗原CD20存在共定位現(xiàn)象，進(jìn)一步通過(guò)流式分選法獲取潰瘍性結(jié)腸炎小鼠和正常小鼠結(jié)腸組織B細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠B細(xì)胞的CCL2 轉(zhuǎn)錄水平明顯高于正常小鼠。綜合以上研究結(jié)果，潰瘍性結(jié)腸炎結(jié)腸組織中的B細(xì)胞是CCL2的主要來(lái)源之一，并可通過(guò)趨化作用募集巨噬細(xì)胞至結(jié)直腸組織內(nèi)參與潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展。