57例脊柱感染手術患者NGS檢測分析

劉春，朱超，臧雨峰，黃必軍，何博，張振，張玉發，錢明

(1.青島大學附屬上海德濟醫院骨科，上海 200331；2.青島大學附屬上海德濟醫院檢驗科，上海 200331；3.海軍軍醫大學附屬長征醫院骨科，上海 200003)

脊柱感染發病率為0.004‰～0.01‰，其死亡率為2%～4%，其中以胸腰椎感染多見[1-2]。主要原因是病原體在脊柱部位的定植，其病原體包括細菌、真菌、病毒及結核分支桿菌等。脊柱感染包括脊椎骨髓炎、椎間盤炎和硬膜外膿腫等，常由遠處病灶血行播散至1個或多個椎體引起，其他感染原因還包括臨床有創操作，如穿刺操作、針灸、手術等，也可見于鄰近組織播散等[2-5]。脊柱感染的診斷主要根據臨床癥狀、體征、實驗室檢查、影像學檢查等，常規微生物培養作為感染診斷的直接證據是診斷感染的金標準[2，6-7]，但其存在需要足夠細菌載量、培養周期較長以及假陰性率高等諸多不足，不利于感染疾病的快速精確診斷。目前隨著基因檢測技術的進步，宏基因二代測序(next-generation sequencing technology，NGS)技術在腦脊液、血液、假體周圍感染等標本中的諸多檢測優勢已逐步展現[8-11]，目前感染科、呼吸科已廣泛用于血液、體液標本的檢測。金文婷等[5]2020年曾報道通過CT引導穿刺抽取感染病灶送檢NGS及常規微生物培養，NGS在病原檢測陽性率、檢測周期方面均表現出明顯優勢，能夠快速的檢測出致病原，指導臨床早期精確治療。但目前關于脊柱感染的NGS檢測相關研究較少，本研究通過手術取出脊柱感染病灶組織，同時行NGS及培養基培養檢測，對兩者檢測陽性率、檢測周期進行回顧性對比分析，探討NGS在脊柱感染診治中臨床價值，研究結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2018年6月至2020年12月年在青島大學附屬上海德濟醫院行開放手術治療的脊柱感染患者的臨床資料進行回顧性對比分析研究，本次統計病例共計80例，去除后期病理檢測證實為腫瘤9例，未送檢NGS檢測14例，共57例納入研究。57例中男性41例，女性16例；年齡21～76歲，平均年齡為(55.32±12.56)歲。感染部位：頸椎10例，胸椎20例，腰椎27例。脊柱感染診斷參考2019年歐洲核醫學協會、歐洲骨與關節感染學會和歐洲放射學會聯合發布的外周骨感染診斷指南[12]，包括：(1)可能存在部分神經功能障礙；(2)實驗室檢查：C-反應蛋白及血沉偏高，血白細胞、降鈣素原可正常；(3)可有發熱病史，伴有病變部位疼痛；(4)影像學檢查提示脊柱骨質侵犯，骨髓水腫、侵蝕[12-13]。手術指征包括：(1)神經癥狀進行性加重，病程>3個月；(2)疼痛視覺模擬評分(visual analogue scale，VAS)≥5分；(3)胸腰椎日本骨科協會(Japanese orthopaedic association，JOA)評分≤15分。

1.2 納入與排除標準 納入標準：(1)年齡>18歲；(2)綜合術前影像學檢查及實驗室檢查、病史等資料，初步診斷脊柱感染；(3)有疼痛、麻木感等神經癥狀。排除標準：(1)術后病理證實為腫瘤；(2)未送檢NGS或培養基培養。本研究經醫院倫理委員會審查通過。

1.3 脊柱病灶組織取樣方法 57例均行后路開放手術，取出病灶組織同時送檢NGS及常規微生物培養。

1.4 檢測方法

1.4.1 常規微生物培養 標本接種于分區劃線的血平板和巧克力平板，血平板、巧克力平板放CO2培養箱。35 ℃培養18～24 h。病灶組織標本成組織勻漿，分別接種于血瓊脂平板細菌培養，接種于念珠菌顯色平板行真菌培養，分枝桿菌培養系統(MGIT960)進行分枝桿菌培養。

1.4.2 NGS檢測 樣本處理和DNA提取：按照標準樣本采集流程采集標本，進行物理破壁、酶破壁，混合震蕩后取300μL樣本按照TIANamp Micro DNA Kit試劑盒步驟提取DNA。文庫構建和測序：對提取好的核酸進行酶切片段化、末端修復、接頭連接及聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)進行文庫構建，使用Agilent 2100 Bioanalyzer質控文庫片段大小為300 bp左右，使用Qubit dsDNA HS Assay Kit質控DNA文庫濃度，檢測后的濃度按照等質量進行混合測序，混合后的文庫經環化形成單鏈。再經復制加載到測序芯片，使用BGISEQ-50/MGISEQ-2000進行測序。數據分析：通過bwa序列比對將高質量數據中比對上人參考基因組序列的數據去除。剩下的數據在去除低復雜度reads后與華大pmdb病原數據庫進行比對，獲得能夠匹配到某種病原體的序列數，根據序列數的高低以及臨床其他檢測來判斷可能的病原體。

2 結 果

2.1 檢測細菌分析 通過NGS檢測出細菌病例數達到28例，通過常規微生物培養檢測出細菌病例數為9例，兩者對比差異有統計學意義(F=13.579，P<0.001)，NGS檢測方法具有顯著性優勢(見表1)。

表1 NGS與常規微生物培養檢出結果(例)

57例中NGS檢測陽性共計38例，陽性率66.7%，陽性結果中細菌感染共28例，占73.7%。NGS檢測出序列數最高的主要致病細菌以葡萄球菌、鏈球菌、腸球菌為主，其中6例存在3種以上細菌混合感染，7例存在2種細菌混合感染，15例為1種細菌感染，另外細菌感染合并其他微生物如結核、真菌感染多達15例。培養基培養檢測陽性10例，陽性率26.3%，細菌9例、真菌1例(見表2，見圖1)。

表2 主要致病細菌結果分布(例)

圖1 NGS檢測細菌種類詳細分布圖

2.2 真菌、病毒、結核分枝桿菌結果分析 NGS檢測結果，真菌感染陽性8例(14.0%)，病毒檢測陽性12例(21.1%)，結核分支桿菌陽性12例(21.1%)。常規微生物培養僅有真菌1例陽性。

2.3 檢測周期結果分析 常規微生物培養檢測周期3～7 d，平均時間(5.0±2.1)d；NGS檢測周期24～36 h，平均時間(30.4±6.2)h。NGS檢測相比常規微生物培養檢測所需周期更短。

3 討 論

脊柱感染發病率較低，感染科、骨科及影像科醫生很難將其與非感染性疾病相區分。以往的檢測技術(如常規微生物培養)很難明確致病原，脊柱感染確診多數依賴于臨床、實驗室及影像學資料，血液培養陽性率較低，病灶組織無法獲取送檢標本，且培養基培養陽性率僅35%左右[5]。培養周期相對較長，臨床治療多依賴于經驗性抗感染，缺乏針對性。對于難以診斷的脊柱感染病例，診斷學穿刺是確診及鑒別診斷的最佳方案。既往研究報道經CT引導下穿刺的陽性率為47%～100%。若穿刺前已進行抗感染治療，活檢微生物結果極大可能出現假陰性。金文婷等[5]曾研究CT引導穿刺取出病灶組織送檢NGS指導臨床治療，NGS作為新一代檢測手段，在脊柱感染早期快速診斷、開展精準治療方面具有更大的優勢，通過人類基因庫數據比對，NGS檢測在膿毒血癥[14]、假體周圍感染[15]、中樞感染[16]中已展示出快速、準確的優勢。本研究中，對于符合手術指征的病例，采用開放手術取出病灶組織行NGS檢測，發現NGS檢測有利于快速明確脊柱感染的致病原，為臨床早期精準治療提供關鍵的病原學依據。

作者觀察的38例檢測陽性病例中微生物分布以細菌為主，占陽性結果的73.7%，與以往臨床研究結果一致[17]。NGS檢測周期一般為24～36 h，相比常規微生物培養周期(需要72 h以上)，檢測周期明顯減少，為臨床早期、快速治療創造了條件。在厭氧菌感染中，李冰等[14]曾報道NGS檢測陽性率達到82.76%；而在假體周圍感染病例中，郝林杰等[8]曾報道NGS檢測陽性率也達到88.2%。金文婷[5]曾報道NGS檢測在脊柱感染病例中陽性率達到62.5%，與本研究的66.7%陽性率基本相一致。

本研究中，結核分枝桿菌NGS檢測陽性12例，陽性率達到21%，檢測周期平均(24±8)h，與文獻報道肺外結核發病率10%以上相符合[18]。然而12例結核菌感染病例常規微生物培養無陽性病例，因此NGS在檢測結核菌感染中具有明顯的優勢。

在常規微生物培養陽性率較低的真菌中，NGS檢測陽性率也達到14%，與文獻報道真菌感染陽性率11.3%一致，脊柱感染以念珠菌及曲霉菌最為常見[19]。甚至在無法培養的病毒感染病例中，NGS檢測陽性率達到了21.1%。楊新明卜等[20]曾報道布氏桿菌脊柱感染病例中，手術取標本送檢膿液培養陽性結果率僅50%。本研究中有1例初步診斷感染病例中，曾使用萬古霉素、美羅培南等多種高級抗生素治療，體溫無法控制，炎癥指標持續上升，通過NGS檢測，術后24 h即快速明確診斷為布氏桿菌感染，術后針對病原菌抗感染治療后癥狀得以控制，患者臨床療效較好。

綜上所述，對比常規微生物培養，NGS檢測在細菌感染病例中檢測陽性率更高同時周期更短，特別是在真菌、病毒感染病例中具有顯著性優勢，且在部分非特異性感染病例中，諸如布氏桿菌、結核分支桿菌等培養基培養無法明確的微生物具有絕對的優勢[21-22]。因此，NGS檢測技術在脊柱感染手術治療病例中發揮了重要的作用，值得大力推廣。本文病例基數少，缺乏大樣本數據分析，且隨訪周期相對較短，還需要更長時間隨訪、更高質量的隨機對照研究評估NGS在脊柱感染中的臨床應用價值。