基于核酸切割機理的熒光分析法檢測水相中銅離子

胡伶俐，曾 超，肖 穎，劉長輝*

(1. 湖南城市學院 材料與化學工程學院，湖南 益陽 413000；2. 湖南省產商品質量檢驗研究院，長沙 410007)

銅離子(Cu2+)是生物體內一種不可或缺的微量元素，在生理和病理過程中發揮著非常重要的作用[1-2].人體內Cu2+的缺乏會引發白細胞減少和骨質疏松癥等疾病[3]，而過量的Cu2+則會損傷肝、腎等器官[4].已有研究表明，從食物、飲用水或其他來源吸收過量的Cu2+會引發嚴重的神經衰弱等疾病[5-6].因此，開發一種選擇性檢測水樣中Cu2+的方法具有非常重要的意義.近年來，傳統的高靈敏度、高選擇性Cu2+檢測方法，諸如原子吸收光譜法[7]、電感耦合等離子體原子發射光譜法[8]等，引起了人們的廣泛關注.與傳統方法相比，熒光光譜法具有操作簡單、靈敏度高、選擇性好等優勢而備受關注[9-12].

核酸熒光探針具有物理和化學特性穩定、易合成等性質，且核酸具有被核酸酶和羥基自由基切斷的特性[13-14].該探針已被應用于酶活性[14-16]、DNA[17]、蛋白質[18]及金屬離子[13,19-20]的檢測.眾所周知，核酸與某些小分子、聚合物能夠產生聚集誘導效應[21-23]，從而改變小分子染料的熒光發射光譜.抗癌藥物阿霉素(Dox)是一種具有熒光特性的有機分子，它在水相中能夠產生強烈的熒光，但在雙鏈DNA(dsDNA)中易被誘導聚集而使熒光淬滅[24-25].本文利用Dox 在dsDNA 中聚集后的熒光淬滅和過氧化氫(H2O2)與Cu2+間發生芬頓反應所產生的羥基自由基(·OH)切斷dsDNA 的機理，構建了一種選擇性檢測水相中Cu2+的熒光分析方法.

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

U-3010 型紫外-可見分光光度計(日本島津公司)；F-4600 型熒光光度計(日本島津公司).

DNA(生工生物工程(上海)股份有限公司)，其他試劑購自北京百靈威科技有限公司，所用試劑均為分析純.實驗用水為超純水系統(Barnstead/Thermolyne Corp., Dubuque, IA)制備的超純水(18.2 MΩ·cm).

1.2 dsDNA 母液配制

取200 μmol/L 互補單鏈DNA 各125 μL，加入48 μL HEPES 緩沖溶液(10 mmol/L，pH=7.0)；繼續加入1.5 μL MgCl2溶液(1.0 mol/L)和0.5 μL KCl 溶液(5.0 mol/L)；于沸水浴中加熱5 min 后，放入冰箱上層冷卻，制得dsDNA 母液，備用.

1.3 光譜測定

在比色皿中加入10 mmol/L HEPES 緩沖液400 μL，再加Dox 溶液(5.0 mmol/L)5.0 μL；繼續加入一定量的dsDNA 母液、0.5 mmol/L H2O2和一定量的Cu2+溶液，測定其紫外-可見吸收光譜；以480 nm 作為激發波長，保持狹縫為10 nm/10 nm 不變，測定其熒光發射光譜.

1.4 Cu2+含量測定

測定方法同1.3，用0.5 mL 待測液替代Cu2+標準溶液，利用標準工作曲線計算樣品中的Cu2+濃度.每份樣品平行測定3 次.

2 結果與討論

2.1 銅離子核酸探針的構建

為了考察Dox 與dsDNA 作用前后的光物理性質的變化情況，在HEPES(10 mmol/L，PH=7.0)緩沖溶液中加入5.0 L 的Dox 溶液(5.0 mmol/L)，再加入一定量的dsDNA 母液，測定其紫外-可見吸收光譜和熒光發射光譜，結果如圖1 所示.

由圖1A 可知，Dox 在480 nm 處展現特征吸收；dsDNA 的加入使其在260 nm 處產生了DNA的特征吸收峰；芬頓試劑(H2O2+Cu2+)的加入使得260 nm 處的吸收峰形狀發生了明顯變化，但480 nm處的吸收峰形狀保持不變.圖1B則表明，Dox在550 和590 nm 處產生強的熒光信號，且隨著dsDNA 的加入，熒光信號顯著減弱，而芬頓試劑(H2O2+Cu2+)又使體系的熒光信號明顯增強.其原因可能是：Dox 具有聚集誘導熒光淬滅的性質，其分子嵌入dsDNA 的空隙后形成聚集態，導致了熒光淬滅；而芬頓試劑產生的·OH 切斷了DNA，釋放出Dox，使體系的熒光增強.這表明核酸探針(Dox/dsDNA)被成功構建.

圖1 Dox 加入dsDNA 和芬頓試劑(H2O2+Cu2+)前后的紫外-可見吸收光譜(A)和熒光發射光譜(B)

2.2 可行性研究

為了驗證該檢測體系的可行性，在HEPES(10 mmol，pH=7.0)緩沖溶液中，固定H2O2含量(0.5 mmol/L)，考察探針Dox/dsDNA 與芬頓試劑的響應情況，結果如圖2 所示.

由圖2A 可知，Dox/dsDNA 在550 和590 nm處的熒光強度很弱，加入H2O2和Cu2+對其熒光信號的變化可以忽略不計，芬頓試劑(H2O2+Cu2+)的加入卻使體系的熒光強度明顯增強.由圖2B發現，Dox 展現較強的熒光信號；dsDNA 的加入使體系的熒光信號顯著減弱；H2O2的加入對體系的熒光信號無影響；Cu2+的加入卻使體系的熒光信號明顯增強，且響應速率快(＜100 s)，可實現對Cu2+的快速檢測.其原因可能是H2O2和Cu2+發生芬頓反應產生·OH 切斷了DNA，破壞了其聚集狀態并釋出Dox 分子，從而恢復了Dox 的熒光.

圖2 探針Dox/dsDNA 加入H2O2、Cu2+和H2O2/Cu2+前后的熒光發射光譜(A)；Dox 加入dsDNA 和H2O2/Cu2+后的熒光響應速率(B)

2.3 dsDNA 長度對Cu2+響應的影響

在HEPES(10 mmol，pH=7.0)緩沖溶液中加入含不同堿基數的dsDNA 與Dox 作用，再與Cu2+響應，考察dsDNA 的長度對體系熒光恢復程度的影響，結果如圖3 所示.

圖3 dsDNA 長度對探針Dox/dsDNA 加入Cu2+前后的熒光恢復程度的影響

由圖3 可知，固定Dox 的濃度，加入不同堿基數的dsDNA 均可使Dox 的熒光信號展現不同程度的淬滅現象，Cu2+的加入則使體系的熒光信號均有不同程度的恢復；當dsDNA 為15 個堿基時，體系的熒光強度增幅最大.因此，在后續實驗中，選擇的dsDNA 長度均為15 個堿基.

2.4 干擾實驗

在相同實驗條件下，依次加入Fe3+、Zn2+、Mg2+、Al3+、Ag+、Cu2+、Ca2+、Hg2+、Cl-、Na+、F-、K+、CO32-、Ni2+、SO42-、PO43-、HPO42-、Pb2+、ClO-和NO3-等常見離子，分別考察體系熒光信號的變化情況，結果如圖4 所示.

圖4 探針Dox/dsDNA 對常見離子的響應

由圖4 可以看出，僅有Cu2+展現顯著的熒光增強.此結果表明，探針Dox/dsDNA 僅在芬頓試劑中有響應，可選擇性檢測Cu2+.

2.5 Cu2+檢測

在HEPES(10 mmol，pH=7.0)緩沖溶液中，固定H2O2含量(0.5 mmol/L)，考察Cu2+濃度對探針Dox/dsDNA 的影響，結果如圖5 所示.

圖5 探針Dox/dsDNA 對不同Cu2+濃度的響應(A)；Cu2+濃度與體系熒光強度變化的關系(B)

由圖5A 可知，體系在480 和590 nm 處展現較弱的熒光信號；隨著Cu2+濃度的增加，480 和590 nm 處的熒光信號顯著增強；當Cu2+濃度為100 mol/L 時，在590 nm 處的熒光強度增加了9.7倍.由圖5B 可知，當Cu2+濃度為1.0～50.0 mol/L時，體系熒光強度的變化程度與Cu2+濃度呈良好的線性關系，其回歸方程為y=1.059x+0.115 8，線性相關系數R2=0.992 6，檢測限為0.3 mol/L.這表明該Dox/dsDNA 探針可有效檢測Cu2+.

2.6 實際樣品檢測

在HEPES(10 mmol，pH=7.0)緩沖溶液中，固定H2O2含量(0.5 mmol/L)，將Dox/dsDNA 探針用于飲用水中Cu2+的檢測，結果如表1 所示.

表1 飲用水中Cu2+的檢測

由表1 可以看出，Dox/dsDNA 探針對Cu2+的加標回收率為97.0%～101.2%，獲得了滿意的測定結果.因此，核酸探針Dox/dsDNA 可有效地測定實際樣品中的Cu2+含量.

3 結論

根據dsDNA 誘導Dox 聚集并淬滅其熒光信號，以及Cu2+與H2O2反應產生的·OH 可以切斷DNA 而恢復Dox 熒光信號的機理，建立了核酸探針選擇性檢測Cu2+的熒光分析方法.結果表明，當Cu2+濃度為1.0～50.0 mol/L 時，其與檢測體系的熒光信號強度變化呈良好的線性關系，檢測限為0.3 mol/L.該體系響應速率快(＜100 s)、選擇性好、靈敏度高，且具有較強抗干擾能力，可用于實際水樣的Cu2+檢測.由于該探針的構建是通過Dox 與dsDNA 間的嵌合作用，故其穩定性有待進一步提高.