干旱脅迫與復水對北柴胡生長和根部次生代謝物含量的影響

劉喬斐

(安康學院現代農業與生物科技學院,安康 725000)

隨著全球氣候干暖化的持續加劇,水分已經成為世界干旱半干旱地區植物生長發育的首要限制因子,干旱脅迫后植物的恢復能力是評價其抗旱性強弱的重要指標[1]。

中藥材生產以“優質、高產、穩定、可控”為發展方向,提高中藥材栽培技術是保障中藥材提質增效的根本任務[2]。 藥用植物中的藥效成分大多是其次生代謝物,當植株受到干旱、水淹、熱害、冷害等環境脅迫后,細胞出現生理脫水或缺氧,滲透平衡被打破,引起膜脂過氧化、活性氧代謝失調、抗氧化酶活性改變,誘導體內的抗氧化防御反應,影響次生代謝產物的合成,進而影響藥用植物的生長發育和藥材質量[3-4]。 黃璐琦等[5]研究發現,水分脅迫能促進次生代謝產物的合成,有利于道地藥材的形成。 次生代謝產物的積累是道地藥材研究的熱點之一,也是中藥材生產的目的之一[6]。 柴胡(Bupleurum chinense DC.)為傘形科柴胡屬多年生草本植物,主要以干燥的根入藥。 柴胡味苦、辛,性微寒,具退熱解表、升舉陽氣、疏肝解郁之功效,多用于治療感冒發熱、頭痛目眩、月經不調、子宮下垂等[7]。 由于長期無節制采挖,野生柴胡資源瀕臨枯竭,已無法滿足市場需求。 目前,柴胡藥材主要來源于人工栽培,但因對柴胡生長習性了解不多,人工栽培調控措施不夠完善,以致藥材的質量和規格難以保證。 因此,加強柴胡栽培生產薄弱環節的理論研究,對實現柴胡質量穩定可控具有重要的促進作用。 本試驗通過研究干旱脅迫與復水對北柴胡生長及多糖、皂苷和黃酮3 種主要藥用成分積累的影響,旨在為柴胡規范化栽培提供理論依據和技術指導。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗材料為2 年生北柴胡,在陜西省寶雞市陳倉區拓石鎮孟家塬村陜西博仁藥業柴胡基地開展盆栽試驗。 選用上口徑25 cm、高20 cm 的塑料花盆,每盆裝土2.5 kg。 供試土壤為沙壤土,速效氮含量11.49 mg∕kg,速效磷含量3.34 mg∕kg,速效鉀含量10.0 mg∕kg,土壤含水量為7.56%。 于2019 年4 月5日將2 年生柴胡移栽入塑料盆中,每盆3 株,共120 盆。 移栽后正常澆水,緩苗10 d 后進行干旱脅迫處理。 采用稱重法進行水分控制,控水期間每天18:00 定時稱盆質量,以盆質量的減少量為柴胡的當日耗水量,并加水補充至設定土壤含水量。 對照盆為裸土。 為保持盆內水分恒定,在每個塑料盆下面墊一張塑料紙。

試驗設置4 個處理,每處理3 次重復,每組10 盆。 各處理分別是:(1)不脅迫處理組(CK):每日控水至土壤飽和含水量的75%;(2)一次干旱脅迫與復水周期(Ⅰ):每日控水至土壤飽和含水量的35%,持續干旱脅迫3 d 后恢復供水,使田間持水量達到土壤飽和含水量的75%,繼續培養2 d;(3)兩次干旱脅迫與復水周期(Ⅱ):每日控水至土壤飽和含水量的35%,持續干旱脅迫3 d 后恢復供水,使田間持水量達到土壤飽和含水量的75%,繼續培養2 d,重復2 個周期;(4)三次干旱脅迫與復水周期(Ⅲ):每日控水至土壤飽和含水量的35%,持續干旱脅迫3 d 后恢復供水,使田間持水量達到土壤飽和含水量的75%,繼續培養2 d,重復3 個周期。 分別于復水前和復水后1 d、2 d 各采樣一次。

1.2 主要儀器與試劑

Waters 高效液相系統配有:Waters1525 二元泵,Waters2996 二極管陣列檢測器,Waters sun-fire C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),Empower2 色譜分析軟件;KQ3200DB 型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);3K15 型臺式高速冷凍離心機(SIGMA);紫外可見分光光度計(PerkinElmer Lambda 35)。柴胡皂苷對照品均購于中國食品藥品檢定研究院(柴胡皂苷a 批號110777-201309,柴胡皂苷d 批號110778-201409),乙腈為色譜純(美國Tedia 公司),氨水、甲醇等為分析純。

1.3 測試項目與方法

1.3.1 柴胡生長指標的測定

各組隨機選取3 株長勢一致的植株,用直尺和游標卡尺分別測量柴胡的株高、根長和根直徑,之后放入105 ℃烘箱殺青30 min 后80 ℃烘干至恒重,稱量地上、地下干重,計算柴胡的生物量和根冠比[8]。

1.3.2 柴胡根中皂苷含量的測定

參考張宇等[9]的方法,取干燥至恒重的柴胡根研磨成粉末,準確稱取0.2 g 于10 mL 離心管中,加含5%濃氨水的甲醇溶液8 mL,超聲提取30 min,過濾,并用10 mL 甲醇分2 次洗滌離心管和殘渣,7 000 r∕min離心10 min,取上清,洗液和濾液合并回收至干容量瓶。 殘渣用適量甲醇溶解,并轉移至5 mL容量瓶中,定容至刻度線處。 上樣前用0.45 μm 濾膜過濾,作為樣品溶液。 HPLC 條件參照2005 年版《中國藥典》[10]。

1.3.3 黃酮類化合物的測定

稱取烘干柴胡根樣品2.0 g,置于50 mL 容量瓶中,加入甲醇35 mL 浸泡2 h 后超聲提取30 min,加甲醇至刻度,放置24 h 即得總黃酮提取液。 根據王小青等[11]的方法,利用黃酮類化合物與呂鹽反應生成紅色絡合物,以蘆丁為對照品,紫外分光光度計測定總黃酮含量。 準確吸取提取液2.0 mL 置于25 mL 容量瓶,定容。 在510 nm 處測吸光值,代入公式Y=10.153X-0.007 3(R2=0.989 9),計算總黃酮含量。

1.3.4 多糖含量的測定

參考張立等[12]的方法,以無水葡萄糖為對照品繪制標準曲線,紫外分光光度計法測定可溶性糖和粗多糖的含量,總多糖含量為可溶性糖和粗多糖含量之和。

取柴胡粉碎樣品1.0 g,置于250 mL 錐形瓶中,加入82%乙醇45 mL,超聲提取30 min,過濾,重復2次,將濾液合并置于100 mL 容量瓶中,用82%甲醇定容。 取0.6 mL 濾液于試管中,加入0.4 mL 水、5 mL蒽酮硫酸溶液,于620 nm 處測定吸光度,代入Y=0.143 6X+0.033 6(R2=0.999 1),計算可溶性糖含量。

將250 mL 錐形瓶置于水浴鍋,蒸干可溶性糖,剩下的濾渣中加入2% HCL 45 mL,沸水浴1 h,放置至室溫后再過濾至100 mL 容量瓶中,重復提取一次。 合并濾液至100 mL 容量瓶中,用2% HCL 定容。 取0.6 mL于試管中,加入0.4 mL 水、5 mL 蒽酮硫酸溶液,于620 nm 處測定吸光度。 代入Y =0.143 6X +0.033 6(R2=0.999 1),計算粗多糖含量。

1.4 數據處理

利用SPSS 22.0 軟件進行單因素方差分析,采用LSD 和Duncan 多重比較法進行顯著差異性檢驗,采用SigmaPlot 12.0 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 不同干旱脅迫與復水周期對北柴胡生長指標的影響

由圖1 可知,干旱脅迫后柴胡的根長和根直徑均增加,株高降低。 復水前,處理Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的根長和根直徑分別較CK 增加13.52%和21.58%、29.47%和21.58%、32.19%和38.0%,株高降低10.09%、21.16%和25.11%。

圖1 不同處理對北柴胡根長、根直徑和株高的影響Fig.1 Effects of different treatments on the root length,root diameter and plant height of B.chinense

復水后1 d,處理Ⅱ、Ⅲ的根長較CK 增加35.32%和25.54%,較復水前增加13.17%和2.82%。 各處理的根直徑分別較CK 增加12.5%、25.3%和15.9%。 處理Ⅱ的株高較CK 增加3.21%,處理Ⅰ、Ⅲ的株高與CK 差異不顯著;處理Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的株高分別較復水前增加23.23%、46.79%和52.70%。 復水后2 d,與CK 相比,處理Ⅱ、Ⅲ的根長分別增加38.56%和25.21%,根直徑分別增加22.35%和33.41%,株高分別增加10.75%和6.47%,處理Ⅰ的根長、根直徑和株高與CK 差異均不顯著。 綜上,復水后柴胡的根長和株高表現出一定的補償效應,其中處理Ⅱ的增幅效應較明顯。

由圖2 可知,干旱脅迫后柴胡的根干重不斷降低,根冠比先減小后增大。 復水前,處理Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的根干重分別較CK 降低14.04%、31.58%和42.11%,根冠比降低46.74%、34.82%和16.48%。 復水后1 d,處理Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的根干重分別較復水前增加4.08%、17.95%和78.79%;處理Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的根冠比分別較復水前增加1.0%、6.88%和3.44%。 復水后2 d,處理Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的根干重分別較CK 增加17.54%、64.91%和117.54%,表現出明顯的補償效應,處理Ⅲ的增幅效應較明顯。 處理Ⅰ的根冠比仍顯著低于CK,處理Ⅱ的根冠比恢復到CK 水平,處理Ⅲ的根冠比較CK 增加65.94%,表現出一定的補償效應。

圖2 不同處理對北柴胡根干重、冠干重、生物量和根冠比的影響Fig.2 Effects of different treatments on the root dry weight,shoot dry weight,biomass and root shoot ratio of B.chinense

隨著干旱脅迫周期的增加,柴胡的冠干重和生物量均表現出先增加后降低的趨勢。 復水前,與CK 相比,處理Ⅰ的冠干重和生物量分別增加61.39%和34.18%,處理Ⅲ的冠干重和生物量分別降低30.69%和34.81%,處理Ⅱ的冠干重與CK 差異不顯著,生物量顯著降低。 復水后1 d,處理Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的冠干重和生物量分別較CK 增加82.61%和46.98%、27.17%和9.40%、31.52%和20.81%,較復水前增加3.07%和3.30%、10.38%和12.41%、72.86%和74.76%。 復水后2 d,冠干重和生物量持續增加。 處理Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的冠干重和生物量分別較CK 增加48.89%和39.58%、55.56%和58.33%、31.11%和56.77%,較復水前增加23.31%和26.42%、98.11%和109.66%、152.86%和192.23%,表現出明顯的補償效應,處理Ⅲ的增幅效應較明顯。

圖3 不同處理對北柴胡根中柴胡皂苷a、d 和總皂苷含量的影響Fig.3 Effects of different treatments on the content of saikosaponin a,d and total saikosaponin in the root of B.chinense

2.2 不同干旱脅迫與復水周期對柴胡根中皂苷含量的影響

由圖3 可知,干旱脅迫后柴胡根中的柴胡皂苷a、d 和總皂苷含量均增加。 復水前,與CK 相比,處理Ⅱ、Ⅲ的柴胡皂苷a 的含量均顯著增加,處理Ⅰ與其差異不顯著;處理Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的柴胡皂苷d 和總皂苷的含量分別增加55.78%和28.10%、76.88%和64.29%、96.48%和73.57%,柴胡總皂苷的含量隨著干旱周期的增加不斷增加。 復水后1 d,與CK 相比,處理Ⅱ、Ⅲ的柴胡皂苷a 含量增加61.09%和112.67%,較復水前增加5.33%和39.05%,處理Ⅰ與CK 差異不顯著;處理Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的柴胡皂苷d 和總皂苷含量分別增加99.50%和49.05%、 166.33%和110.95%、 102.51%和107.86%。 復水后2 d,柴胡皂苷a、皂苷d 和總皂苷含量持續增加。 處理Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的柴胡皂苷a、皂苷d 和總皂苷含量分別較CK 增加53.85%、146.73%和97.86%,131.67%、181.91%和155.48%,118.55%、142.71%和130.0%,表現出明顯的補償效應,處理Ⅱ的增幅效應較明顯。

圖4 不同處理對北柴胡中黃酮類含量的影響Fig.4 Effects of different treatments on the content of flavonoid in the root of B.chinense

2.3 不同干旱脅迫與復水周期對北柴胡根中黃酮類和多糖含量的影響

由圖4 可知,干旱脅迫后柴胡根中的黃酮含量增加。 復水前,處理Ⅱ、Ⅲ下黃酮類的含量分別較CK 增加20.0%和16.25%,處理Ⅰ與CK 差異不顯著。 復水后1 d,處理Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的黃酮類含量分別較CK 增加36.25%、77.5%和31.25%,較復水前增加22.47%、47.92%和12.90%;復水后2 d,黃酮類的含量增加,處理Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的黃酮類的含量分別較CK 增加80.0%、157.50% 和 76.25%, 較 復 水 前 增 加 61.80%、114.58%和51.61%,表現出明顯的補償效應,處理Ⅱ的增幅效應最明顯。

由圖5 可知,干旱脅迫后柴胡中的可溶性多糖、粗多糖和總多糖含量均增加。 復水前,處理Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的可溶性糖、粗多糖和總多糖的含量分別較CK 增加395.45%、21.74%和47.01%,412.50%、28.71%和54.67%,239.77%、29.61%和44.56%。 復水后1 d,處理Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的可溶性糖、粗多糖和總多糖的含量分別較CK 增加437.50%、23.30% 和51.30%,580.68%、32.57% 和70.21%,398.86%、33.22% 和62.79%,較復水前增加8.49%、1.28% 和2.92%,32.82%、7.52% 和10.05%,46.82%、2.20% 和12.61%;復水后2 d,處理Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的可溶性糖、粗多糖和總多糖的含量分別較CK 增加462.50%、28.06%和57.43%,700.0%、65.87%和108.73%,450.0%、48.24%和75.42%,較復水前增加13.53%、5.19%和7.08%,56.10%、28.87%和34.95%,61.87%、13.72%和21.35%,表現出明顯的補償效應,處理Ⅱ的增幅效應較明顯。

圖5 不同處理對北柴胡中可溶性糖、粗多糖和總多糖含量的影響Fig.5 Effects of different treatments on the content of soluble sugar,crude polysaccharide and total polysaccharides in the root of B.chinense

3 結論與討論

柴胡以根入藥,一般認為根越粗、越長,藥材所含總皂苷、黃酮、多糖含量越高,柴胡藥材品質越好[13]。根類中藥材,作為一類特殊的植物,其生長和藥效成分的合成積累與環境水分密切相關[14]。 適宜水分條件下,藥用植物根系生長良好,構型合理,產量高,但不利于藥效成分的合成[15]。 研究表明,適度干旱脅迫可以調節植物地上、地下生物量的分配,促進根系生長[16],增強藥用植物體內次生代謝,促進藥效成分的合成與積累[17],從而提高中藥材的產量與品質。 曾智等[18]研究發現,適度干旱和適量鉀肥有利于厚樸中主要藥效成分厚樸酚與和厚樸酚的積累。 孔德鑫等[19]研究發現,適當的干旱脅迫有利于兩種雞骨草中皂苷含量的積累。 鄧婉月等[20]研究發現,輕度和中度干旱脅迫有利于丹參中酚酸和丹參酮類活性成分的積累。 本研究中,干旱脅迫促進柴胡根系的生長,抑制株高的增加,促進柴胡根中皂苷、黃酮、多糖等次生代謝產物的合成。 復水后柴胡的生長抑制程度有所緩解,表現出一定的補償效應。 分別表現為:兩次、三次干旱復水周期下柴胡的根長、根干重、冠干重和根冠比顯著增加,這與前人的研究結果一致[21],說明干旱脅迫能夠促進柴胡根系的生長,增加根系的吸水面積[16]。

可溶性糖作為重要的滲透調節物質,在植物抵御逆境脅迫時具有降低細胞滲透勢和水勢,維持膨壓的作用[22]。 本研究中,不同干旱脅迫與復水周期下柴胡根的可溶性糖含量顯著增加,有利于提高柴胡的抗旱性能。 黃酮類化合物是藥用植物中重要的次生代謝產物,具有多種生理生化功能,能夠通過抗氧化作用在一定程度上減輕干旱脅迫引起的膜脂抗氧化作用對植物造成的傷害[23]。 本研究中,干旱脅迫下柴胡根的黃酮化合物積累量增加,這與李柯等[24]和屠玲艷等[25]的研究結果相似,說明柴胡遭遇水分虧缺時,其體內黃酮代謝增強,柴胡的抗氧化能力提高,進而抵制因干旱脅迫產生的自由基[26]。

本研究中,不同干旱復水周期下柴胡根中皂苷a、皂苷d、黃酮類、可溶性糖、粗多糖、總多糖的含量均增加,其中兩個干旱復水周期下各指標的增幅效應最明顯。 表明當環境水分虧缺時,柴胡生長受到抑制,同化產物減少,次生代謝增強,次生代謝產物積累用于抵御逆境脅迫[9];但若干旱脅迫持續加劇,柴胡自身生長受阻,次生代謝產物合成最終也會減少[5]。 梁建萍等[27]研究發現,輕度水分脅迫能有效啟動黃芪體內次生代謝,通過降低地上部分的生長,將營養物質優先運往根部,促進根產量及藥材質量的提高。 胡婭婷等[14]研究發現,輕度干旱脅迫能夠有效促進黃芪幼苗生長并提高黃芪藥材品質,但重度干旱脅迫下次生代謝物含量降低。

綜上,柴胡具有一定的耐旱性;干旱脅迫有利于柴胡生物量向地下部的轉移,可以促進柴胡有效成分的積累;復水對柴胡的干旱鍛煉具有正向補償效應。 因此,在人工栽培柴胡時,要采用科學合理的控水方式,在保障植物正常生長的同時,促進柴胡次生代謝產物的積累,提高柴胡的產量和品質。