10 種稻田常用殺菌劑對蚯蚓的急性毒性效應

孫麗娜,黃開華,高新華,陳 偉,黃萬金,呂衛(wèi)光

(上海市農(nóng)業(yè)科學院生態(tài)環(huán)境保護研究所,上海低碳農(nóng)業(yè)工程技術研究中心,上海 201403)

近年來,進入土壤的污染物種類和數(shù)量不斷增加,致使土壤的結構和功能持續(xù)惡化,部分生態(tài)系統(tǒng)平衡受到嚴峻挑戰(zhàn),嚴重威脅人類生存安全[1-3]。 相關研究表明,我國耕地受到的農(nóng)藥污染非常嚴重[4-5],目前尚未找到可以完全替代農(nóng)藥作用的其他產(chǎn)品。 因此,規(guī)避使用中高毒農(nóng)藥,推廣低毒農(nóng)藥,對保障生態(tài)系統(tǒng)安全具有重要意義。 蚯蚓是陸生生物量最大的一類土壤動物,在土壤物理性質改良和植物營養(yǎng)循環(huán)方面起著重要作用[6]。 蚯蚓對多種污染物比其他土壤動物更為敏感[7],能直接或者間接反應環(huán)境污染帶來的危害,也可對生態(tài)污染起到早期預警作用[8]。 利用蚯蚓指示土壤污染狀況,已經(jīng)成為土壤污染生態(tài)毒理診斷的一個重要指標[9]。

國內外關于農(nóng)藥對蚯蚓的生態(tài)毒理效應已有一些報道。 宋偉華等[10]采用人工土壤法研究了16 種農(nóng)藥對赤子愛勝蚓的急性毒性,發(fā)現(xiàn)新煙堿類農(nóng)藥吡蟲啉、呋蟲胺、噻蟲胺對蚯蚓的急性毒性為中毒,其他13 種農(nóng)藥均為低毒。 姜錦林等[11]采用人工土壤法測定了11 種常用農(nóng)藥對赤子愛勝蚓的急性毒性效應,發(fā)現(xiàn)11 種常用農(nóng)藥毒性等級從高到低依次為吡蟲啉>噻蟲啉>克百威>毒死蜱>阿特拉津>阿維菌素>草甘膦>吡蚜酮>噻嗪酮>高效氯氰菊酯和百草枯,其中吡蟲啉、噻蟲啉和克百威對赤子愛勝蚓為中毒,其余為低毒。 王娟[12]研究表明,吡蟲啉不但能使蚯蚓感到不適,而且可引起蚯蚓自身細胞中DNA損傷,當吡蟲啉達到一定濃度時,會誘導產(chǎn)生DNA 交聯(lián)作用。 閆軼亞等[13]研究表明,毒死蜱和對硫磷對蚯蚓的急性毒性均屬于低毒。 馮磊[14]研究發(fā)現(xiàn),新煙堿類殺蟲劑對蚯蚓的存活率、酶系、皮膚和腸道細胞等有不同程度的損害。 潘波[15]研究了農(nóng)藥克百威對蚯蚓的毒性,發(fā)現(xiàn)蚯蚓的死亡率與土壤中的克百威含量呈正相關,將克百威歸屬于中等毒性農(nóng)藥。 已有報道都是一類或幾種農(nóng)藥對蚯蚓生態(tài)毒理的研究,尚無對生產(chǎn)實際中稻田常用殺菌劑進行系統(tǒng)探究,因此,需要篩選對水稻有害生物高效防控、對蚯蚓和環(huán)境安全的殺菌劑種類。 威廉環(huán)毛蚓(Pheretima guillelmi)為上海稻田土壤的常見種和優(yōu)勢種,目前尚未有以威廉環(huán)毛蚓為材料研究農(nóng)藥或殺菌劑對其毒理效應的報道。 本研究擬采用人工土壤法[16]和自然土壤法[17]測定10 種稻田常用殺菌劑對威廉環(huán)毛蚓的急性毒性,探究其對蚯蚓的分子毒理學效應、劑量-效應關系等,為農(nóng)田系統(tǒng)安全用藥提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試藥品

60%井岡霉素(validamycin)、10%嘧苷素(pyrimidin)、95%塞呋酰胺(thirluzamide)、40%寧南霉素(ningnanmycin)、95%己唑醇、97%甲基硫菌靈(thiophanate-methyl)、97%稻瘟靈(isoprothiolane)、40%蠟芽菌(wax bud bacteria)、98%氟環(huán)唑(epoxiconazole)、97%戊唑醇(tebuconazole)和90%三環(huán)唑(tricyclazole)均購自南京三舒生物科技有限公司。

1.1.2 供試動物

選用上海市農(nóng)業(yè)科學院蚯蚓養(yǎng)殖實驗室提供的威廉環(huán)毛蚓(Pheretima guillelmi),預養(yǎng)7 d,挑選2 月齡以上、體重1.5 g 左右、環(huán)帶明顯的健康成蚓進行試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 人工土壤法

根據(jù)OECD207 Guideline NO.207 中的標準方法配制人工土壤[16]。 試驗威廉環(huán)毛蚓在不含殺菌劑的人工土壤中馴養(yǎng)24 h。 將殺菌劑溶于丙酮后拌入10 g 石英砂中,待丙酮揮發(fā)完全后與490 g 人工土壤混勻,加入去離子水至土壤含水量為35%。 將配制好的人工土壤放入500 mL 標準玻璃瓶中,加入10 條威廉環(huán)毛蚓,用塑料薄膜封好,并用解剖針扎孔,保證空氣的流通;然后將培養(yǎng)皿放入溫度為20 ℃、濕度為80%的恒溫箱中光照培養(yǎng)。 供試殺菌劑設置0.1 mg∕kg、1 mg∕kg、10 mg∕kg、100 mg∕kg、1 000 mg∕kg 5 個濃度進行預試驗,以確定導致威廉環(huán)毛蚓0—100%死亡率的濃度范圍。 根據(jù)預試驗結果,每種殺菌劑設5 個濃度,每個濃度設置3 個重復,并設置不含殺菌劑的空白對照組(蒸餾水)和溶劑對照組(丙酮)。 分別在7 d 和14 d 計數(shù),記錄威廉環(huán)毛蚓死亡數(shù)量和中毒癥狀,當威廉環(huán)毛蚓的前尾部對機械刺激無反應時視為死亡。

1.2.2 自然土壤法

采用未被污染的自然土壤進行試驗,參考上述人工土壤法并稍加改進。 水稻收獲后,從上海市農(nóng)業(yè)科學院莊行基地稻田中采集深度5—15 cm 的土壤,土壤pH 6.9,有機質含量2.34%,風干后過100 目(孔徑150 μm)篩備用。 試驗威廉環(huán)毛蚓在不含殺菌劑的自然土壤中馴養(yǎng)24 h。 將殺菌劑溶于丙酮后拌入10 g 土壤中,待丙酮揮發(fā)完全后與490 g 自然土壤混勻,加入去離子水至土壤含水量為35%。 將配制好的土壤放入500 mL 標準玻璃瓶中,加入10 條威廉環(huán)毛蚓,操作同人工土壤法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件的Probit 回歸方法計算殺菌劑對威廉環(huán)毛蚓的半數(shù)致死濃度值(LC50)、95%置信限、卡方值及顯著性值[18]。 人工土壤法和自然土壤法測定的殺菌劑對蚯蚓的毒性分級采用《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價的試驗準則》中的標準:LC50≤1.0 mg∕kg,為高毒級;1.0 mg∕kg 10.0 mg∕kg,為低毒級[19]。

2 結果與分析

本研究所設置的空白對照組和溶劑對照組在試驗過程中均無死亡情況出現(xiàn),蚯蚓活性較高,存活率為100%,符合試驗要求。

2.1 人工土壤法

如表1 所示,隨著染毒時間增長,供試殺菌劑對威廉環(huán)毛蚓的急性毒性增加。 染毒7 d 時,10 種殺菌劑對威廉環(huán)毛蚓的LC50值在13.45—322.79 mg∕kg;染毒14 d 時,10 種殺菌劑對蚯蚓的LC50值為9.79—250.68 mg∕kg。 總體來看,人工土壤法測定的每種殺菌劑對威廉環(huán)毛蚓暴露14 d 均比對其暴露7 d 的急性毒性效應高,其中嘧苷素和蠟芽菌對威廉環(huán)毛蚓的急性毒性效應增加明顯。 在所測定的殺菌劑中,寧南霉素、井岡霉素、嘧苷素和蠟芽菌毒性較低,對威廉環(huán)毛蚓7 d 和14 d 的LC50值均大于100 mg∕kg;稻瘟靈的毒性最高,對威廉環(huán)毛蚓14 d 的LC50值小于10 mg∕kg,為中毒。 供試殺菌劑對威廉環(huán)毛蚓的毒性(14 d )依次為:稻瘟靈>甲基硫菌靈>戊唑醇>噻呋酰胺>氟環(huán)唑>三環(huán)唑>嘧苷素>蠟芽菌>井岡霉素>寧南霉素。

表1 人工土壤法測定10 種殺菌劑對威廉環(huán)毛蚓的急性毒性效應Table 1 Determination of acute toxic effects of 10 fungicides on P.guillelmi by artificial soil method

2.2 自然土壤法

如表2 所示,隨著染毒時間增長,供試殺菌劑對威廉環(huán)毛蚓的急性毒性增加。 威廉環(huán)毛蚓染毒7 d時,嘧苷素、井崗霉素、噻呋酰胺、寧南霉素、蠟芽菌、氟環(huán)唑、戊唑醇和三環(huán)唑的LC50值在14.02—304.07 mg∕kg,甲基硫菌靈和稻瘟靈的LC50值分別為6.53 mg∕kg 和5.74 mg∕kg。 染毒14 d 時,甲基硫菌靈、稻瘟靈和戊唑醇對威廉環(huán)毛蚓的LC50值為4.10—9.65 mg∕kg,均小于10 mg∕kg,為中毒級;其余7 種殺菌劑的LC50值在30.67—244.29 mg∕kg。 總體來看,與人工土壤法測定結果相似,自然土壤法測定的每種殺菌劑對威廉環(huán)毛蚓暴露14 d,均比對其暴露7 d 的急性毒性效應高,其中戊唑醇對威廉環(huán)毛蚓暴露7 d的急性毒性為低毒級,但14 d 的LC50值小于10 mg∕kg,屬于中毒級(表2)。 供試殺菌劑中稻瘟靈、甲基硫菌靈毒性較高,對威廉環(huán)毛蚓7 d 和14 d 的LC50值均小于10 mg∕kg,為中毒級;嘧苷素、井崗霉素、噻呋酰胺、寧南霉素、蠟芽菌、氟環(huán)唑和三環(huán)唑為低毒級。 供試殺菌劑對威廉環(huán)毛蚓的毒性(14 d)依次為:稻瘟靈>甲基硫菌靈>戊唑醇>噻呋酰胺>氟環(huán)唑>三環(huán)唑>嘧苷素>蠟芽菌>井岡霉素>寧南霉素。

表2 自然土壤法測定10 種殺菌劑對威廉環(huán)毛蚓的急性毒性效應Table 2 Determination of acute toxic effects of 10 fungicides on P.guillelmi by natural soil method

3 討論與結論

蚯蚓急性毒性研究可為農(nóng)藥生態(tài)毒性的快速判斷提供依據(jù),為農(nóng)藥慢性毒性試驗和田間試驗設計提供參考。 因此,急性毒性試驗對研究蚯蚓的生態(tài)毒理有重要作用[20]。 在農(nóng)藥登記與環(huán)境安全性評價中,一般采用人工土壤法作為農(nóng)藥對蚯蚓的急性毒性試驗方法。 農(nóng)藥在自然環(huán)境下被土壤的膠體和有機物吸收,通過生物、光、化學氧化的分解作用,使土壤中污染物生物有效性大幅下降,污染物的吸收率下降。自然土壤法模擬蚯蚓的生存環(huán)境,試驗結果貼近真實值,更能準確反映農(nóng)藥對蚯蚓的毒性危害[21],包括農(nóng)藥對蚯蚓的生存和生長發(fā)育及繁殖力的影響[22]。 徐冬梅等[17]采用濾紙接觸法、人工土壤法及自然土壤法研究異丙甲草胺及其S 型對映體對蚯蚓的急性毒性,發(fā)現(xiàn)濾紙法的結果置信區(qū)間較大,可靠性較差,而人工土壤法和自然土壤法的結果相近,毒性等級相差不大,較為穩(wěn)定。 田亞男等[23]研究了殺菌劑氟嗎啉和多菌靈對蚯蚓的急性毒性,發(fā)現(xiàn)氟嗎啉在自然土壤和人工土壤中對蚯蚓表現(xiàn)為低毒性,而多菌靈在自然土壤和人工土壤中的毒性等級分別是低毒級和中毒級。 可見,自然土壤與人工土壤有一定的差異,自然土壤的成分更加復雜,存在不可控因素。 以往研究多采用赤子愛勝蚯蚓[10-17],本試驗采用威廉環(huán)毛蚓作為供試蚯蚓,更切合上海稻田生產(chǎn)實際,研究結果可為實際生產(chǎn)合理施藥提供指導。

本研究采用人工土壤法和自然土壤法測定了10 種稻田常用殺菌劑對威廉環(huán)毛蚓的急性毒性效應,各藥劑處理組威廉環(huán)毛蚓初期出現(xiàn)不鉆土、個體較為安靜等癥狀,后期出現(xiàn)局部腫大潰爛、環(huán)帶膨大等癥狀,高濃度處理組癥狀尤為明顯,死亡后的威廉環(huán)毛蚓身體變軟,并出現(xiàn)不同程度的腐爛。 兩種方法測得的藥劑毒性從大到小均為稻瘟靈>甲基硫菌靈>戊唑醇>噻呋酰胺>氟環(huán)唑>三環(huán)唑>嘧苷素>蠟芽菌>井岡霉素>寧南霉素。 自然土壤法10 種殺菌劑染毒7 d 和14 d 的LC50值均小于人工土壤法,可能是自然土壤中的有機質含量低于人工土壤中有機質含量造成的。 本研究選擇的10 種殺菌劑中,稻瘟靈、甲基硫菌靈和戊唑醇對威廉環(huán)毛蚓毒性較大,施用時需注意其對土壤生物可能的不利影響。 雖然試驗中測定的其他殺菌劑對威廉環(huán)毛蚓毒性較低,低濃度暴露不會導致威廉環(huán)毛蚓的快速死亡,但蚯蚓長期接觸農(nóng)藥會產(chǎn)生慢性毒性效應[24-25],有可能抑制蚯蚓的生長和繁殖。

本試驗表明,10 種稻田常用殺菌劑對威廉環(huán)毛蚓都表現(xiàn)出一定的急性毒性效應,其中稻瘟靈、甲基硫菌靈和戊唑醇對威廉環(huán)毛蚓的急性毒性效應高于噻呋酰胺、氟環(huán)唑、三環(huán)唑、嘧苷素、蠟芽菌、井岡霉素、寧南霉素。 根據(jù)《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則》,人工土壤法測定得出稻瘟靈為中毒,其余9 種殺菌劑為低毒;自然土壤法測定得出稻瘟靈、甲基硫菌靈和戊唑醇為中毒,其余7 種殺菌劑為低毒。 在稻田施用殺菌劑時應盡可能規(guī)避中高毒殺菌劑,優(yōu)先選用低毒殺菌劑。 因此,優(yōu)先選用噻呋酰胺、氟環(huán)唑、三環(huán)唑、嘧苷素、蠟芽菌、井岡霉素、寧南霉素。 目前,這些低毒殺菌劑對蚯蚓的分子毒理學效應尚未明晰,不能忽略低毒殺菌劑對蚯蚓可能的慢性毒性和對環(huán)境的危害作用。 今后應進一步明確殺菌劑對蚯蚓的分子毒理學效應,以全面評價殺菌劑對蚯蚓的生態(tài)風險。