甜瓜白粉病和蔓枯病抗性種質資源的篩選及其抗性來源分析

曹燕燕,刁倩楠,姚東偉,陸世鈞,郟惠彪,張永平?

(1 上海市農業科學院設施園藝研究所,上海市設施園藝技術重點實驗室,上海 201403;2上海惠和種業有限公司,上海 201899)

甜瓜(Cucumis meloL.)為葫蘆科甜瓜屬一年生蔓性草本植物。 甜瓜果實不僅味美香甜,多汁爽口,而且富含多種糖分和維生素,具有很高的營養價值和藥用價值,深受廣大消費者喜愛,為世界十大水果之一[1]。 近年來,我國甜瓜產業規模趨于穩定,種植面積和產量常年穩居世界首位。

白粉病和蔓枯病是甜瓜生產中的主要真菌病害。 白粉病在甜瓜露地栽培和保護地栽培中廣泛發生,該病菌不僅能夠侵染植物的葉片、葉柄和莖蔓,還能侵染其花和果實。 甜瓜感染白粉病后產量下降,果實的成熟度和含糖量受到影響,甜瓜的品質和商品性嚴重降低[2]。 蔓枯病是在甜瓜整個生育期都可發生的一種土傳病害,在苗期發病率較低,在植株生長的中后期發病嚴重,莖蔓和葉片是最主要的發病部位,病害嚴重時還可為害果實[3],其在大田的發病率可達20%—30%,在連作地及設施溫室高達80%,嚴重時甚至會導致絕產[4]。

目前,引起葫蘆科作物白粉病的常見病原菌是單囊殼屬的單囊殼菌Podosphaera xanthii(P.xanthii)和白粉菌屬的二孢白粉菌Golovinomyces cichoracearum(G.cichoracearum)[5],前者是引起我國甜瓜白粉病發生的主要病原菌[6]。 已發現的甜瓜白粉病抗性基因包括Pm-1、Pm-2、Pm-3、Pm-4、Pm-5、Pm-6、Pm-A、Pm-B、Pm-C1、Pm-C2、Pm-D、Pm-E、Pm-F、Pm-G、Pm-W、Pm-X以及Pm-H等,但目前很少有抗性基因被克隆出來[7]。 張海英等[8]研究發現,甜瓜自交系K7-1 白粉病的抗性受一對顯性基因Pm-2F控制,開發的1個SSR 分子標記CMBR120-172與該抗性基因緊密連鎖。 盧浩等[9]研究發現,分子標記Mu7191 與抗白粉病基因Pm-PMR6-1 共分離。 蔓枯病是由亞隔孢殼屬的瓜類黑腐球殼菌所引起,但至今尚未確定致病菌生理小種的分化[10]。 目前已發現Gsb-1、Gsb-2、Gsb-3、Gsb-4、Gsb-5、Gsb-6 等多個蔓枯病抗性基因,但至今未被成功定位和克隆[11]。 而隨著甜瓜基因組研究水平的不斷深入,與甜瓜抗蔓枯病基因Gsb-1、Gsb-4 和Gsb-6 等相關的分子標記不斷被報道[12-15]。

目前,白粉病和蔓枯病主要通過噴施藥劑進行化學防治,但長期單一使用某種化學藥劑不僅易使病原菌產生耐藥性,還會破壞生態環境,進而威脅人類健康[16]。 防治這兩種病害最根本和最經濟有效的方法就是選育優質抗病品種,開展現有種質資源的抗病性鑒定是甜瓜抗病育種的關鍵。 本研究一方面對甜瓜種質資源的白粉病和蔓枯病抗性進行鑒定,另一方面對篩選到的抗病材料進行抗性分子標記分析,以期為甜瓜白粉病和蔓枯病抗性遺傳改良及其抗病雜交組合的配制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的40 份甜瓜種質資源由上海市農業科學院設施園藝研究所提供,具體見表1。 其中,來源為自主選育的甜瓜種質均為高世代純合材料。 試驗所用的白粉病菌和蔓枯病菌均采集自上海市農業科學院莊行試驗基地,經實驗室分離純化獲得。

1.2 甜瓜和病原菌培養

挑選飽滿的甜瓜種子進行浸種催芽,出芽后播種于塑料營養缽中,置于光照培養箱中進行培養,設置晝夜溫度為25 ℃∕20 ℃,光照周期為16 h 光照∕8 h 黑暗。

將保存的白粉病菌接種到易感甜瓜植株上進行大量繁殖用于后續白粉病菌接種試驗。 從保存的蔓枯病菌株挑取純性菌絲塊接種于PDA 培養基上(土豆200 g,葡萄糖20 g,瓊脂15 g,蒸餾水1 L),置于生化培養箱中,25—28 ℃條件下暗培養1 周后用于蔓枯病菌接種試驗。

表1 供試甜瓜種質資源Table 1 Melon germplasm resources used in this study

1.3 病原菌接種

白粉病病菌接種參照Zhang 等[17]的方法,將從感病葉片上掃下的新鮮病菌配制成濃度為106個∕mL的孢子懸浮液,均勻噴灑在植株葉片上,放培養箱培養。 培養條件為16 h 光照∕8 h 黑暗,相對濕度85%—95%。 12 d 后參照張學軍等[18]的方法進行白粉病病情統計。 病情分級標準如下:0 級,無病癥;1 級,病斑面積占整葉面積的1∕3 以下,白粉模糊不清;2 級,病斑面積占整葉面積的1∕3—2∕3,白粉較為明顯;3 級,病斑面積占整葉面積的2∕3 以上,白粉層較厚,連片;4 級,白粉層濃厚,葉面開始變黃,壞死面積占葉面積的2∕3 以下;5 級,葉片壞死面積占整葉面積的2∕3 以上。 其中,病害級別為0—2 的個體記錄為抗病,病害級別為3—5 的個體記錄為感病。

蔓枯病病菌接種采用離體葉片菌絲塊接種方法,具體操作參照Wang 等[19]的方法并稍作改動:剪取甜瓜植株完全展開的第3 或第4 片真葉(保留適當長度葉柄),用無菌水沖洗干凈并晾干后放置到鋪有3層濾紙的培養皿中,用直徑為0.5 cm 的滅菌打孔器切取培養好的菌絲塊,接種于甜瓜葉片的中央,每個葉片接種1 個菌絲塊,每個甜瓜材料至少接種3 個葉片。 將培養皿放在光照培養箱中培養,培養溫度(25 ±1)℃,16 h 光照∕8 h 黑暗,相對濕度90%—95%;5 d 后,測量病斑擴展半徑,取平均值。 葉片侵染病情分級標準參照任琴琴等[20]的方法,具體如下:1 級為高抗(HR),擴展半徑<1.8 cm;2 級為抗(R),1.8 cm≤擴展半徑<2.3 cm;3 級為中抗(MR),2.3 cm≤擴展半徑<2.8 cm;4 級為感(S),2.8 cm≤擴展半徑<3.3 cm;5 級為高感(HS),擴展半徑≥3.3 cm。

1.4 分子標記鑒定

1.4.1 甜瓜基因組DNA 的提取

待植株長至3 葉1 心時,取1.0 g 甜瓜葉片于研缽中,加液氮研磨成粉末,利用植物基因組DNA 提取試劑盒(TSP101-50,北京擎科生物科技有限公司)提取甜瓜基因組DNA。

1.4.2 PCR 反應體系及擴增條件

反應體系為:ddH2O 7 μL,2 ×TSINGKE Master Mix (blue)(含DNA 聚合酶、dNTP 等)10 μL,上游引物和下游引物(10 μmol∕L)各1 μL,DNA 模板(100 ng∕μL)1 μL。 所用引物序列詳見表2。

反應條件:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s,50—55 ℃退火30 s,72 ℃延伸15 s,35 個循環;72 ℃延伸5 min;4 ℃保存;me4em37 引物的擴增程序為:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s,35 ℃退火1 min,72 ℃延伸30 s,35 個循環;72 ℃延伸5 min;4 ℃保存。

表2 白粉病和蔓枯病抗性來源鑒定所用分子標記引物Table 2 Molecular marker primers used for identification of the genetic resistance origin of powdery mildew and gummy stem blight

1.4 數據分析

利用Excel 2010 和SPSS 20.0 軟件對試驗數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 甜瓜白粉病苗期抗性鑒定

40 份甜瓜種質資源的苗期白粉病抗性鑒定結果表明,白粉病抗病材料有11 份,分別為12-1-3A、13-5B、152、162、18-6-1A、18-7-5A、1948-1-1、651、B-1-1-1、M09-13 以及Q-1,其中,材料152 的發病等級為0 級,為免疫材料;其余29 份種質均為感病材料(表3)。

表3 甜瓜種質資源白粉病抗性鑒定Table 3 Identification of powdery mildew resistance of the melon germplasm resources

2.2 甜瓜蔓枯病抗性鑒定

采用離體葉片接種方法對40 份甜瓜種質資源進行苗期蔓枯病抗性鑒定分析。 結果表明,供試材料中,表現抗病的材料有2 份,分別為162 和651;表現中抗的材料有6 份,分別為1948-1-1、41S-19、B-1-1-1、M09-9-1、M09-13 和Q-1;表現高感的材料有2 份,分別為159 和E-1-1-1;其余30 份材料表現為感病(表4)。

2.3 抗白粉病甜瓜材料的抗性來源分析

利用抗白粉病基因分子標記引物me4em37 對苗期人工接種鑒定篩選到的11 份白粉病抗性甜瓜材料進行抗性來源分析發現,12-1-3A、13-5B、152、162、18-6-1A、18-7-5A、1948-1-1、B-1-1-1 以及Q-1 中擴增出目的條帶,表明這9 份材料可能含有與抗病甜瓜收集一號相同的白粉病抗性基因[21](圖1A);通過利用抗白粉病基因分子標記引物CMBR120-172對上述11 份材料進行抗性來源分析發現,152、162、18-6-1A、18-7-5A、B-1-1-1 以及Q-1 可用該引物擴增出172 bp 的目的條帶,表明這6 份抗性材料可能含白粉病抗性基因Pm-2F(圖1B)。

表4 甜瓜種質資源蔓枯病抗性鑒定Table 4 Identification of gummy stem blight resistance of the melon germplasm resources

圖1 甜瓜白粉病抗性材料抗性來源檢測Fig.1 Detection of the genetic resistance origin of the powdery mildew resistant melon

2.4 抗蔓枯病甜瓜材料的抗性來源分析

利用抗蔓枯病基因分子標記引物對篩選到的蔓枯病抗性材料進行抗性來源分析發現,材料162 和651 可用Gsb-1 分子標記引物CMCT505 擴增出190 bp 的目的條帶(圖2A),材料41S-19 可用Gsb-4 分子標記引物CMAT170a 擴增出180 bp 的目的條帶(圖2B),說明這3 個材料可能分別含有相應的蔓枯病抗性基因。

圖2 甜瓜蔓枯病抗性材料抗性來源檢測Fig.2 Detection of the genetic resistance origin of the gummy stem blight resistant melon

3 討論

種質資源評價是育種中最重要的基礎工作。 近年來,隨著我國甜瓜種植面積的逐步擴大,各甜瓜種植區白粉病和蔓枯病危害逐年加重,嚴重制約了甜瓜產業的發展。 盡管目前存在一些白粉病和蔓枯病抗性甜瓜材料,但篩選新的抗病種質資源對甜瓜抗性品種選育及抗病聚合育種仍十分必要。

人工接種鑒定是篩選抗蔓枯病資源的一種重要手段。 目前,國內對甜瓜蔓枯病的抗性鑒定一般采用苗期接種方法,但該方法易受溫度、濕度等環境條件的影響[22-23]。 作為人工接種方法的一種,離體接種鑒定方法具有準確、快速、篩選量大、受外界環境條件影響較小等優點[24],已廣泛應用于甜瓜、黃瓜、西瓜和菜瓜等園藝作物的蔓枯病、疫病和炭疽病等的抗性鑒定[20,24-25]。

本研究通過苗期接種鑒定篩選出11 份甜瓜白粉病抗性材料,其中,9 份材料可用me4em37 分子標記引物擴增出目的條帶,表明其可能含有與甜瓜抗病資源收集一號相同的白粉病抗性基因[21];6 份材料可用CMBR120-172分子標記擴增出目的條帶,表明這些材料可能含有白粉病抗性基因Pm-2F。 另外,有8 份材料利用Mu7191 分子標記可擴增出1 個條帶(結果未顯示),這與盧浩等[9]報道的利用該引物在抗病材料中擴增出3 個條帶的結果不符。 因此,這8 份甜瓜種質材料是否含有抗白粉病基因Pm-PMR6-1 還需進一步分析。

利用蔓枯病抗性基因相關分子標記對篩選出的蔓枯病抗病材料進行抗性來源分析結果表明,162 和651 這2 份材料含有Gsb-1 抗性基因,41S-19 材料含有Gsb-4 抗性基因;未發現材料含Gsb-2、Gsb-3 和Gsb-6抗性基因(結果未顯示)。 已有研究表明,利用分子標記輔助篩選抗病基因的可靠性主要取決于分子標記與基因的連鎖距離,即連鎖距離越近,選擇的準確性越高[26-27]。 本研究中一部分白粉病抗性材料和蔓枯病抗性材料未檢測到抗病基因,其原因可能是所選的分子標記與抗性材料所含的抗病基因的連鎖距離較遠或不連鎖。 因此,為了能夠完整地評價材料的抗病性,需要開發和解析更多與抗病基因緊密連鎖的分子標記。

本研究表明,162、B-1-1-1、M09-13 以及Q-1 材料同時兼抗白粉病和蔓枯病,后續可重點利用這4 份材料與優質甜瓜種質配制雜交組合,并加大甜瓜抗病種質資源的收集和評價鑒定工作。 同時,對現有資源進行遺傳改良,并綜合利用其他生物技術手段和物理手段創制新的種質資源,以期為優質、多抗甜瓜新品種的選育奠定良好的基礎。