鈣衛蛋白在類風濕關節炎診斷中的應用及其潛在的臨床價值

項羽羚，譚立明

（1.鷹潭市人民醫院檢驗科，江西 鷹潭 335000；2.南昌大學第二附屬醫院 江西省醫學重點實驗室，江西 南昌 330006）

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA),是 一種病因未明的、 以炎性滑膜炎為主的慢性系統性自身免疫病[1-2]。 其主要特征是小關節、多關節的對稱性、侵襲性關節炎癥[3]，治療原則主要為早發現、早治療。經典的RA 可以通過實驗室指標結合影像學和臨床癥狀確診，但RA 變化多樣，部分不典型的早期以及血清學指標陰性的患者常存在漏診、誤診，故需要尋找新的指標來完善RA 的診斷。 通過文獻學習發現鈣衛蛋白在RA 患者血清及滑膜液中顯著升高[4-5]，提示鈣衛蛋白可能參與RA 疾病的發生。 鈣衛蛋白是由S100A8 和S100A9 兩種鈣結合蛋白組成的異源二聚體。 作為一種炎癥性蛋白質，廣泛存在于中性粒細胞和吞噬細胞中，參與人體生理代謝， 負責大部分蛋白質生物間的相互作用[6-8]。 本研究通過檢測鈣衛蛋白在RA 組、非RA 組和健康對照組中表達水平以及鈣衛蛋白水平和疾病活動程度之間的聯系， 評價鈣衛蛋白在RA 患者中的診斷價值。 研究RA 與抗突變型瓜氨酸化波形蛋白 （anti-mutant citrullinated vimentin,anti-MCV)、 類風濕性關節因子(rheumatoid factor,RF)和抗環瓜氨酸多肽抗體(anti-cyclic citrullinated peptide antibody, anti-CCP)聯合診斷的價值。 本研究對南昌大學第二附屬醫院和鷹潭市人民醫院183例RA 患者組、144 例非RA 組和48 例健康對照組進行鈣衛蛋白、anti-MCV、RF 和anti-CCP 檢測，結果進行分析和比較，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年1月至2020年12月在南昌大學第二附屬醫院和鷹潭市人民醫院確診的RA 患者183 例為RA 組，56 例骨關節炎（OA）、46 例痛風性關節炎(GA)和42 例強直性脊柱炎（AS)共同組成144 例非RA 組，48 例健康受試者為對照組，所有患者均符合指南診斷標準[9-13]。所有標本均知情同意， 并經南昌大學第二附屬醫院和鷹潭市人民醫院倫理委員會批準。 根據歐洲風濕病聯合會推薦的RA 疾病活動指數DAS28 評分[14]，將RA 組患者分為四個亞組： 高疾病活動組 （n=42，DAS28＞5.1 分）、 中等疾病活動組 （n=48，3.2 分＜DAS28≤5.1 分）、 低疾病活動組 （n=39，2.6 分≤DAS28≤3.2 分）、緩解組（n=54，DAS28＜2.6 分）。

1.2 納入標準 符合以下所有條件予以納入：（1）簽署知情同意協議；（2）診斷明確，影像學、臨床資料完善；（3）無合并其他自身免疫性疾病；（4）健康體檢者檢驗結果無異常。

1.3 排除標準 符合以下其中之一條件予以排除：（1）患有其他自身免疫性疾病；（2）患有某些內分泌疾病；（3）患有心血管疾病；（4）妊娠和哺乳期婦女。

1.4 臨床資料 獲取183 例RA 患者組、144 例非RA 組及48 例健康對照組的臨床資料， 包括疾病持續時間、性別、年齡、晨僵持續時間、28 腫脹和疼痛關節計數(28-SJC 和28-TJC)、疼痛持續時間、患者全身模擬評分(100-mmVAS)。

1.5 方法

1.5.1 標本采集與保存 采集實驗對象空腹靜脈血3 mL,采用分離凝膠加速采血管收集，靜置30 min,TD6M 臺式低速離心機，2 500 r/min 離心15 min。-80 ℃保存備用，避免反復凍融。

1.5.2 鈣衛蛋白、anti-MCV、RF 和anti-CCP 的定量測定 取出保存血清標本，ELISA（上海恒遠生化試劑有限公司） 三重復檢測鈣衛蛋白和anti-MCV水平；全自動特定蛋白儀PA200（深圳市金瑞生物科技有限公司） 速率散射比濁法檢測RF 水平；貝克曼庫爾特AU5800 （中漢盛泰生物技術有限公司）速率散射比濁法檢測anti-CCP 水平。計算各指標的曲線下面積(area under curve，AUC)、 敏感度（sensitivity，Se)、特異度（specificity，Sp)、準確度(accuracy)、約登指數（youden index，YDI)、陽性預測值(positive predict value，PPV)、 陰性預測值(negative predict value，NPV)、陽性似然比(+LR) 和陰性似然比(-LR)各指標。 以上所有操作嚴格遵守各試劑盒和儀器使用說明書及南昌大學第二附屬醫院和鷹潭市人民醫院檢驗科質量管理手冊。

1.6 統計處理采用SPSS 23.0 軟件進行數據統計、處理及分析 計量資料采用K-S 檢驗和Levene's檢驗分別對數據正態性和方差齊性進行檢驗,正態分布用±s 表示，偏態分布用中位數（四分位數間距）[M(QR)]的方式表示。多組正態分布資料比較用One- way ANOVA 檢驗；偏態分布資料組間水平差異采用非參數Kruskal-Wallis 檢驗，繪制受試者工作曲線(ROC)，利用logistic 回歸模型建立2 個指標聯合，通過曲線下面積(AUC)評估鈣衛蛋白診斷RA 的價值; 實驗室相關檢測指標之間相關性采用Pearson 相關分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組一般資料 與非RA 組和健康對照組相比，RA 組的鈣衛蛋白顯著升高（P＜0.01）。組間年齡和性別無顯著差異（P＞0.05）。 見表1。

表1 各組間基本資料

2.2 不同RF 水平組的RA 組鈣衛蛋白水平 不同RF 組的鈣衛蛋白水平RA 組根據RF 的診斷截斷值（20 ng/mL）進一步分為兩個亞組，即RF 水平高于截斷值的RF 陽性組和RF 水平低于RF 截斷值的RF 陰性組。RF 陽性組的鈣衛蛋白水平顯著高于RF 陰性組，且均高于健康對照組（P＜0.01）。 見表2。

表2 各組鈣衛蛋白水平

2.3 RA 組不同活動度鈣衛蛋白水平 RA 組中高疾病活動組、中疾病活動組、低疾病活動組、緩解組鈣衛蛋白水平分別為 (950.66±117.82)pg/mL、(771.68 ±81.38)pg/mL、 (593.96 ±98.62)pg/mL 和（492.89±207.76）pg/mL， 各組之間的統計差異，見圖1A。 通過Pearson 相關分析， 鈣衛蛋白水平與DAS28 評分呈正相關（r=0.572，P＜0.01），見圖1B。

圖1 A：箱線圖顯示不同RA 活動和健康對照的鈣衛蛋白水平。B：鈣衛蛋白與DAS28 相關性.DSA28, 關節疾病活動評估之間的相關性。

2.4 鈣衛蛋白、anti-MCV、RF 和anti-CCP 檢測結果臨床評價 各指標中鈣衛蛋白的特異性最高，RF的靈敏度最高，anti-MCV 的靈敏度和特異性均比較高，見表3。

表3 鈣衛蛋白、anti-MCV、RF 和anti-CCP 檢測結果臨床評價

2.5 鈣衛蛋白結果的ROC 曲線分析 通過計算得到鈣衛蛋白曲線下面積0.844,其95%CI 為0.792～0.897，達到中等診斷價值，對應cutoff 值為584 ng/mL，見圖2A、圖2C；鈣衛蛋白、anti-MCV、RF 和anti-CCP 聯合診斷RA 的ROC 曲線見圖2B、圖2D。

圖2 A：鈣衛蛋白、anti-MCV、RF 和anti-CCP 診斷RA 的特異性和敏感性B：鈣衛蛋白分別聯合anti-MCV、RF 和anti-CCP 診斷RA 的特異性和敏感性。C：各指標的ROC 結果。D：指標聯合檢測ROC 結果。95%CI：95%置信區間。 anti-MCV，抗突變瓜氨酸波形蛋白；RF，類風濕因子；anti-CCP,抗環瓜氨酸多肽抗體；AUC，曲線下面積；ROC，受試者工作特征。

3 討論

RA 主要的病理特征有關節滑膜持續炎癥性增生、血管翳形成[15]，其經典實驗室指標主要有RF和anti-CCP。 現階段尚無能逆轉該病的特效藥，該病嚴重危害人民的健康，造成巨大的經濟負擔。 鈣衛蛋白屬于S100 蛋白家族中的一種[16]，主要表達于樹突狀細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、血管內皮細胞等，在健康人群中就可以檢測出來。 作為一種炎性蛋白，在炎癥期間，主要是從壞死或者活化的中性粒細胞、單核巨噬細胞中釋放，參與多種自身免疫性疾病的致病過程[17-18]。 比如炎性腸病、特發性關節炎、多發性硬化癥等，鈣衛蛋白主要是通過與晚期糖基化終產物受體和Toll 樣受體-4 結合而發揮作用， 同時還可加速骨小梁的構建和軟骨基質的鈣化。有文獻明確了鈣衛蛋白在不同RA 活動度中表達存在差異[19]，提示鈣衛蛋白很可能參與了RA 的發病進程。

本研究結果顯示RA 組鈣衛蛋白水平明顯高于非RA 組和健康對照組，非RA 組結果顯著高于健康對照組，RA 組結果也明顯高于OA、GA、AS組，表明在炎性關節病變中，尤其是RA 患者中鈣衛蛋白確有升高，可能與疾病發生機制相關。 按照DAS28 評分分組結果顯示：高疾病活動組、中疾病活動組、低疾病活動組均高于健康對照組，且各組之間具有顯著差異（P＜0.05)；緩解組和健康對照組差異無統計學意義（P＞0.05)。 說明鈣衛蛋白在RA不同活動度中表達存在顯著差異，和RA 疾病發展進程呈正相關,與Van Hoovels L 等[20]的結論基本一致，由此可以判斷鈣衛蛋白水平可以用于RA 疾病的診斷及病情發展評估。

將RA 組分成RF 陽性組和RF 陰性組， 比較RF 陽性組、RF 陰性組、 健康對照組和非RA 組鈣衛蛋白水平， 結果顯示RF 陽性組和RF 陰性組鈣衛蛋白水平顯著高于健康對照組和非RA 組。 與Bae S.C 等[21]結論基本相符。 在RF 陽性RA 患者中，RF 和鈣衛蛋白水平顯著升高，提示鈣衛蛋白可以輔助RF 診斷RA，提高診斷準確性；在RF 陰性RA 患者中，鈣衛蛋白水平升高，提示鈣衛蛋白檢測可避免漏診； 同時可以和非RA 組疾病區分，避免誤診。 鈣衛蛋白擬為RF 陰性的RA 患者的診斷增加新的靶點，從而為RA 患者早期診斷、鑒別診斷、發展進程評估提供新的思路。

經ROC 曲線分析,鈣衛蛋白、anti-MCV、RF 和anti-CCP 的AUC 面積 分 別 為0.844、0.914、0.894和0.885，anti-MCV 的AUC 面積最高，鈣衛蛋白的AUC 面積接近經典指標RF、anti-CCP,表明鈣衛蛋白同經典指標一樣有較好的診斷價值； 鈣衛蛋白聯合anti-MCV、RF 和anti-CCP 診斷RA 的AUC面積分別為0.953、0.947 和0.917,診斷效能進一步增強，略高于Zhu J 等[22]結論，可能和試劑廠家不同有關。 從4 組指標臨床評價分析， 當截斷值為584ng/mL 時, 鈣衛蛋白對RA 診斷的靈敏度和特異性分別為65.67%、89.72%,其中鈣衛蛋白的陽性預測值(0.909)、陽性似然比(6.669)、特異性(89.72%)均高于其他3 組，陽性預測價值較高；RF 的靈敏度為88.53%、陰性預測值為0.806，均高于其他3 組,陰性預測價值較高， 但RF 在老年人和其他自身免疫性疾病患者血清中也會升高，造成其特異性不高[23-24]；anti-MCV 的約登指數為0.675，高于其他3 組，診斷價值較高。 Van Hoovels L 等[25]研究指出， 鈣衛蛋白可以在經典指標RF 和anti-CCP 陰性情況下顯著升高，具有很高的特異性，通過聯合診斷，可以提高RA 的診斷效能。

綜上所述，鈣衛蛋白檢測對RA 患者的診斷和鑒別診斷具有臨床意義， 并且聯合RF、anti-CCP和anti-MCV 能進一步提高診斷價值，有望成為輔助診斷RA 患者的一個新的實驗指標； 同時其與RA 患者臨床疾病活動度之間存在密切關系，對評估和監測RA 患者病情有重要的指導和參考意義。