羅伊氏乳酸桿菌FLRE5K1 補(bǔ)充改善順鉑致小鼠肝損傷及腸道菌群紊亂的效果

張楠，葉水文，王新露，羊玉林，劉靜，王小中

（1.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科 江西省檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院輸血科，江西 南昌 330006）

順鉑是各種實(shí)體腫瘤最常用的化療藥物之一[1]。順鉑化療的過程中容易出現(xiàn)許多不良反應(yīng)，包括肝毒性、神經(jīng)毒性、腎毒性、胃腸道毒性、卵巢和子宮毒性等[2-4]，這些毒副作用的存在嚴(yán)重限制了其在臨床中的使用。 如何安全改善化療帶來的毒性是順鉑治療中一直以來關(guān)注的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

羅伊氏乳酸桿菌FLRE5K1 （Lactobacillus reuteri FLRE5K1） 是課題組從健康小鼠肝臟中分離的內(nèi)源性益生菌。 由于人體99%的微生物都定植在腸道， 人體內(nèi)源性益生菌的研究主要還是集中在腸道微生物與腸道疾病的關(guān)系上[5]，而關(guān)于實(shí)體器官內(nèi)源性益生菌的研究非常少。 益生菌被證實(shí)對肝臟的健康具有保護(hù)作用，主要機(jī)制是益生菌改變了腸道微生物的組成與功能[6]。 因此，本文通過構(gòu)建順鉑肝損傷模型， 探討L.reuteri FLRE5K1 菌補(bǔ)充對順鉑致小鼠肝損傷及腸道菌群紊亂的影響。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑 雄性C57BL/6 小鼠（6～8 周齡，體重22±2 g），購于北京維通利華生物科技有限公司。 動物實(shí)驗(yàn)得到了江西省實(shí)驗(yàn)動物管理委員會批準(zhǔn)的[許可證編號SYXK（贛）2021-0004]。 L.reuteri FLRE5K 菌由南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。 順鉑購于上海伊卡生物技術(shù)有限公司， 血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、 谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總膽紅素（TB）和直接膽紅素（DB）試劑盒購于寧波瑞源生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備日本Olympus BX51 型光學(xué)顯微鏡、德國賽多利斯BSA124S 分析天平、美國貝克曼Microfuge 20R 高速離心機(jī)、美國賽默飛ABI750 實(shí)時熒光定量PCR；華西克拉泰CR-601ST 石蠟切片機(jī)、 美國貝克曼Beckman AU5400 全自動生化分析儀。

1.3 方法

1.3.1 L. reuteri FLRE5K1 發(fā)酵乳的制備 將L.reuteri FLRE5K 菌在37 ℃下MRS 肉湯中培養(yǎng)18 h， 將1 mL 培養(yǎng)物接種到100 mL 脫脂乳中， 并在37 ℃的厭氧條件下培養(yǎng)24 h，最終密度109cfu/mL用于體內(nèi)灌胃實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 小鼠動物模型的建立 將小鼠分為C 組、FLRE5K1 組、DDP 組和DDP+FLRE5K1 組，每組6只。 C 組小鼠接受100 μL 的脫脂牛奶灌胃，F(xiàn)LRE5K1 組小鼠每天接受100 μL 109cfu/mL L.reuteri FLRE5K1 發(fā)酵乳灌胃，DDP 組腹腔隔天注射25 mg/kg 順鉑，DDP+FLRE5K1 組小鼠腹腔隔天注射25 mg/kg 順鉑的同時給予100 μL 109cfu/mL L.reuteri FLRE5K1 發(fā)酵乳灌胃。 干預(yù)第20 d，眼眶靜脈叢采血。

1.3.3 小鼠肝功能檢測 小鼠血置于4 ℃的冰箱中12 h，然后以2 800×g 離心10 min，收集上清液。采用Beckman AU5400 全自動生化分析儀檢測ALT、AST、TB 和DB，檢測時均進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)量控制，所有數(shù)據(jù)采集后，再嚴(yán)格按照操作規(guī)程進(jìn)行。

1.3.4 小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)觀察 取小鼠肝右葉邊緣肝臟組織，多聚甲醛固定，石蠟包埋，蘇木精—伊紅染色染色， 中性樹膠封片， 在光學(xué)顯微鏡下（×400） 觀察各組小鼠肝臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)， 按照Knodell HAI 肝臟組織學(xué)評分系統(tǒng)進(jìn)行評分。

1.3.5 小鼠腸道菌群16SrRNA 高通量測序 干預(yù)第20 天，取DDP 組和DDP+FLRE5K1 組小鼠新鮮的大便，采用Master Pure DNA 試劑盒提取樣本中DNA， 通過Nanodrop2000 分光光度計(jì)測定所提取DNA 濃度及純度，將合格的DNA 樣本送至深圳華大基因科技有限公司進(jìn)行16SrRNA 高通量測序。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0 軟件對本研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝功能血清學(xué)指標(biāo) 各組小鼠血清肝功能的檢測結(jié)果， 見圖1。 C 組和FLRE5K1 組小鼠血清ALT 和AST 未見差異。 DDP 組小鼠血清中ALT 和AST 水平明顯升高，其均值為C 組和FLRE5K1 組2.5～3.0 倍左右。 DDP+FLRE5K1 組小鼠血清ALT和AST 雖然高于C 組和FLRE5K1 組， 但與DDP組相比，DDP+FLRE5K1 組小鼠血清中ALT 及AST水平均明顯降低。 四組小鼠血清TB 和DB 值均在正常水平，未出現(xiàn)顯著性差異。

圖1 四組小鼠血清ALT、AST、TB 和DB 的差異

2.2 肝臟組織病理學(xué)變化 四組小鼠的肝臟組織病理組織結(jié)果，見圖2。 C 組和FLRE5K1 組小鼠，肝索結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞胞漿均勻，肝細(xì)胞無水腫；DDP 組小鼠肝細(xì)胞輕—中度水腫，胞漿疏松，局部肝細(xì)胞出現(xiàn)氣球樣變， 肝索結(jié)構(gòu)及竇周隙模糊；DDP+FLRE5K1 組小鼠， 未見氣球樣變的肝細(xì)胞，肝索結(jié)構(gòu)及竇周隙清晰。 相比DDP 組，DDP+FLRE5K1 組小鼠肝細(xì)胞水腫程度減輕， 未見氣球樣變的肝細(xì)胞。

圖2 四組小鼠肝組織蘇木精—伊紅染色（×400）

2.3 DDP 組與DDP+FLRE5K1 組小鼠腸道菌群16SrRNA 測序結(jié)果

2.3.1 腸道菌群多樣性分析 兩組小鼠腸道菌群的Shannon 指 數(shù)， 見 圖3。 與DDP 組 相 比，DDP+FLRE5K1 組小鼠糞便樣本中腸道菌群小鼠Shannon 指數(shù)明顯升高。相比DDP 組，DDP+FLRE5K 組小鼠腸道菌群豐富度和多樣性組顯著增加。

圖3 DDP+FLRE5K1 組和DDP 組小鼠腸道菌群組成的多樣性指數(shù)分析

2.3.2 腸道菌群門水平上的差異分析 兩組小鼠腸道菌群門水平的分布， 見圖4。 與DDP 組小鼠相比，DDP+FLRE5K 組厚壁菌（Firmicutes）門 和變形桿菌 （Proteobacterias） 門豐富度升高， 擬桿菌門（Bacteroidetes）豐富度降低。

圖4 DDP+FLRE5K1 和DDP 組小鼠腸道菌群在門水平上的分布差異

2.3.3 腸道菌群屬水平上的差異 對兩組小鼠腸道菌群菌屬分析結(jié)果，見圖5。DDP+FLRE5K1 組小鼠腸 道 菌 群 中Barnesiella 屬、Oscillibacter 屬、Prevotella 屬和Alistipes 屬豐富度較DDP 組升高。 而Clostridium_XlVa 屬、Helicobacter 屬、Acetatifactor屬和Alloprevotella 屬豐富度較DDP 組下降。

圖5 DDP+FLRE5K1 和DDP 組小鼠腸道菌群在屬水平上的分布差異

3 討論

順鉑作為腫瘤化療最常見的藥物， 其肝毒性不容忽視。 因此，尋找能夠減輕順鉑化療肝損傷的物質(zhì)是非常必要的。 益生菌可以通過調(diào)節(jié)腸道菌群組成和功能，發(fā)揮保護(hù)肝臟的作用[7]。 L.reuteri FLRE5K1益生菌是小鼠肝臟中分離的內(nèi)源性益生菌，其對肝臟的保護(hù)作用值得探討。

本研究發(fā)現(xiàn)， 攝入L.reuteri FLRE5K1 菌能使腹腔注射順鉑小鼠的血清ALT 及AST 水平下降，但是小鼠的TB 和DB 并沒有發(fā)生明顯的改變。ALT 和AST 是反映肝細(xì)胞膜穩(wěn)定性最敏感的指標(biāo)[8]，在肝發(fā)生輕微損傷時，肝細(xì)胞膜通透性就會增加， 轉(zhuǎn)氨酶被釋放到血液中， 因此早期肝損傷時，血清中ALT 和AST 就會升高。 肝臟疾病發(fā)生時膽紅素升高常常反映較嚴(yán)重的肝細(xì)胞損害，本研究小鼠TB 和DB 未發(fā)生明顯改變的原因， 可能與順鉑干預(yù)時間較短、濃度較低有關(guān)。 本實(shí)驗(yàn)順鉑通過腹腔注射的方式接觸肝臟， 我們選取接觸部位的肝組織進(jìn)行病理觀察發(fā)現(xiàn)， 相比DDP 組，DDP+FLRE5K1 組小鼠肝細(xì)胞水腫程度減輕。 可見， 攝入L.reuteri FLRE5K1 菌能夠一定程度上減輕順鉑對肝臟的毒性。

肝臟和腸道具有非常密切的關(guān)系， 肝臟70%的血供來源于門靜脈， 腸道內(nèi)營養(yǎng)豐富的血液通過門靜脈不斷向肝臟輸送， 這個過程伴隨著各種腸道微生物群衍生代謝物和產(chǎn)物的低水平暴露[9]。 當(dāng)順鉑化療或其他因素造成腸道菌群紊亂時，腸道促炎性細(xì)胞因子及內(nèi)毒素含量增加，腸道屏障的通透性增高， 這些有害物質(zhì)透過受損的腸黏膜進(jìn)入血液，通過門靜脈輸送至肝臟，引起肝臟損傷[10]。 因此，腸道菌群的穩(wěn)定對預(yù)防肝損傷具有重大意義。 益生菌是腸道菌群強(qiáng)有力的調(diào)控因素，它可以影響已有的腸道共生微生物， 促進(jìn)有益細(xì)菌的繁殖[11-12]。

本研究對DDP 組和DDP+FLRE5K1 組小鼠的腸道菌群進(jìn)行16SrRNA 測序發(fā)現(xiàn)， 補(bǔ)充L.reuteri FLRE5K1 能明顯增加順鉑化療小鼠腸道菌群的豐富度和多樣性。 對屬水平上分析發(fā)現(xiàn)，DDP+FLRE5K 組小鼠腸道菌群中Barnesiella 屬、Oscillibacter 屬、Prevotella 屬 和Alistipes 屬 豐 富 度 較DDP 組增加，這與Li 等[13]研究結(jié)果較一致。 Barnesiella 屬能減輕腸道炎癥水平， 對腸道具有保護(hù)作用[14]。 Alistipes 是腸道中主要產(chǎn)生短鏈脂肪酸的細(xì)菌， 是抑制肝臟炎癥和肝癌重要保護(hù)因素[15]。Oscillibacter 屬是一種戊酸鹽產(chǎn)生菌， 能夠增強(qiáng)在體內(nèi)產(chǎn)生IL-10 的Treg 的分化，抑制腸道炎癥[16-17]。這些有益菌比例升高無疑有利于減輕順鉑導(dǎo)致的肝損傷。

順鉑化療容易造成小鼠肝臟損傷及腸道菌群紊亂。 口服L.reuteri FLRE5K1 菌一方面作為益生菌參與腸道菌群的構(gòu)成， 更為重要的是該菌的攝入能增加對肝臟具有保護(hù)作用的菌群的豐富度，從而起到改善順鉑造成的小鼠肝損傷及腸道菌群紊亂的作用。 目前，關(guān)于實(shí)體器官內(nèi)源性益生菌與疾病的研究極少， 本研究初步探討了肝臟內(nèi)源性益生菌L.reuteri FLRE5K1 對肝損傷及腸道菌群的影響， 為將來更深入地研究實(shí)體器官內(nèi)源性益生菌提供支持。