FOXA2、ALK 在肺腺癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征、預(yù)后的關(guān)系

段會娟，陳嵐，鄧青，張勇峰

（河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，河南 洛陽 471003）

肺腺癌是肺癌中較常見的病理分型， 約占肺癌的50%[1]。 隨著分子生物學(xué)醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，分子靶向治療逐漸應(yīng)用于臨床。 叉頭框架蛋白A2（Forkhead box protein A2，F(xiàn)OXA2） 是一種具有抗細(xì)胞增殖作用的轉(zhuǎn)錄因子， 在上皮性卵巢癌、肝細(xì)胞肝癌、 肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌等癌癥中表達(dá)下調(diào)，并與癌癥發(fā)生及進(jìn)展有關(guān)[2]。 間變性淋巴瘤激酶（Anaplastic lymphoma kinase，ALK） 是一種受體酪氨酸激酶，在細(xì)胞代謝、增殖、生長、凋亡等方面具有關(guān)鍵作用，其在人正常組織中均不表達(dá)，但在食管鱗狀細(xì)胞癌、 神經(jīng)母細(xì)胞瘤等腫瘤中呈高表達(dá)， 并在這些腫瘤發(fā)病過程中扮演重要角色[3]。然而， 目前FOXA2、ALK 在肺腺癌發(fā)病過程中的作用及其關(guān)系尚不清晰，因此本研究分析了FOXA2、ALK 在肺腺癌中的表達(dá)及其與臨床病理特征、預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 獲得本院倫理委員會批準(zhǔn)， 收集2014年5月至2017年5月我院確診并收治的肺腺癌患者117 例。 入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)病理活檢確診為肺腺癌；（2）入組前均沒有接受過放化療；（3）病歷資料完整；（4）無其他惡性腫瘤。 排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并嚴(yán)重精神系統(tǒng)疾病；（2）近期有嚴(yán)重外傷史或者出血史；（3）依從性差，無法完成定期隨訪；（4）哺乳期或妊娠期女性；（5）隨訪期間失訪。 在117例患者中，男性68 例，女性49 例，年齡23～80 歲，平均年齡（60.42±6.12）歲，＜60 歲50 例，≥60 歲67例； 腫瘤直徑＜3 cm 的52 例，≥3 cm 的65 例；根據(jù)國際通用的惡性腫瘤TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)， Ⅰ～Ⅱ期76 例，Ⅲ～Ⅳ期41 例。所有患者及家屬對本研究充分知情，并簽署知情同意書。

1.2 免疫組織化學(xué)檢測 收集117 例肺腺癌患者術(shù)中切除的肺腺癌組織和癌旁正常肺組織，用10%中性甲醛鋅固定液（上海一研生物科技有限公司）對標(biāo)本進(jìn)行固定，然后脫水，用SPCC-6D 生物組織石蠟包埋機(jī) （東莞市譜標(biāo)實驗器材科技有限公司）包埋成塊，用EMS5000 系列振動組織切片機(jī)（湖南遠(yuǎn)湘生物科技有限公司） 切成厚度約4 μm的連續(xù)切片， 然后依次脫蠟、 抗原修復(fù)、PBS 漂洗、過氧化物酶阻斷，滴加第一抗體FOXA2（濃度1∶300，上海振譽生物科技有限公司）和ALK（濃度1∶200， 上海科敏生物科技有限公司），37℃培養(yǎng)1.5 h 后PBS 漂洗， 再滴加SupervisionTM 鼠/兔通用二抗（北京博蕾德生物科技有限公司），室溫培養(yǎng)20 min 后PBS 漂洗，然后依次進(jìn)行DAB 顯色試劑盒（沈陽萬類生物科技有限公司）顯色、蘇木精（上海萬生昊天生物技術(shù)有限公司）復(fù)染、梯度酒精（南京云橋生物科技有限公司）脫水、中性樹脂固封劑（上海瓦蘭生物科技有限公司）封片，最后在Leica 徠卡雙目生物顯微鏡DM500（南京貝登醫(yī)療股份有限公司） 下觀察FOXA2、ALK 表達(dá)情況。由兩位經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)生在雙盲情況下使用顯微鏡觀察陽性細(xì)胞率和染色程度。 參照楊長俊等[4]實驗中的免疫組化結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，將陽性細(xì)胞率與著色程度評分之積作為最終得分， 最終得分0～3 分判定為陰性，最終得分＞3 分判定為陽性。

1.3 隨訪方式 采用電話及門診復(fù)查相結(jié)合的方法進(jìn)行隨訪，參加本研究后第1年，每3 個月隨訪一次；第2年開始每6 個月隨訪一次，隨訪至參加本研究后36 個月或死亡為止， 記錄3年生存率，隨訪的內(nèi)容為常規(guī)體格檢查和胸部CT 平掃。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件對本試驗所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析， 文中的計數(shù)資料采用例數(shù)（%）形式表示，組間計數(shù)資料比較采用配對卡方檢驗，組間生存率比較采用Log-rank χ2檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier 法。設(shè)定檢驗水準(zhǔn)為0.05，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FOXA2、ALK 在肺腺癌組織、癌旁正常肺組織中表達(dá)陽性率的比較 肺腺癌組織中FOXA2 表達(dá)陽性率顯著低于癌旁正常肺組織，ALK 表達(dá)陽性率顯著高于癌旁正常肺組織， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。 見表1、圖1。

圖1 FOXA2、ALK 在肺腺癌組織和正常肺組織中的免疫組化染色結(jié)果(SP，×400)

表1 FOXA2、ALK 在肺腺癌組織、正常肺組織中表達(dá)陽性率的比較[n(%)]

2.2 FOXA2、ALK 表達(dá)與肺腺癌臨床病理特征的關(guān)系 肺腺癌組織表達(dá)FOXA2 與患者性別、年齡、腫瘤直徑無顯著相關(guān)性（P>0.05），與組織分化程度、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性（P<0.05）。 肺腺癌組織表達(dá)ALK 與患者性別、年齡、腫瘤直徑、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無顯著相關(guān)性（P>0.05），與組織分化程度有顯著相關(guān)性（P<0.05）。 見表2。

表2 FOXA2、ALK 表達(dá)與肺腺癌臨床病理特征的關(guān)系

2.3 FOXA2、ALK 表達(dá)與肺腺癌預(yù)后的關(guān)系FOXA2 陽性表達(dá)患者的3年生存率57.50%（23/40）較FOXA2 陰性表達(dá)患者37.66%（29/77）顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（Log-rank χ2=4.812，P=0.028）。 見圖2。

圖2 FOXA2 陽性表達(dá)和陰性表達(dá)患者3年生存率的Kaplan-Meier 分析

ALK 陽性表達(dá)患者的3年生存率29.41%（5/17）較ALK 陰性表達(dá)患者47.00%（47/100）顯著降低， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 （Log-rank χ2=4.502，P=0.034）。 見圖3。

圖3 ALK 陽性表達(dá)和陰性表達(dá)患者3年生存率的Kaplan-Meier 分析

3 討論

肺癌是一種原發(fā)于肺部的惡性腫瘤， 其危險因素包括吸煙、接觸致癌物質(zhì)、肺部慢性感染、遺傳易感性等，其早期臨床癥狀不明顯，如咳嗽、低熱、胸悶等，確診時多已發(fā)生血行轉(zhuǎn)移，累及骨、肝、腎、胰等臟器，失去最佳的治療時機(jī)，目前已成為全球發(fā)病率和致死率最高的惡性腫瘤。 近年來，肺腺癌成為肺癌中發(fā)病率最高的類型， 治療后易復(fù)發(fā)，預(yù)后大多不良。 因此，研究與肺腺癌發(fā)生、發(fā)展有關(guān)的生物學(xué)因素具有重要的臨床指導(dǎo)意義。

FOXA2 是一種具有翼狀螺旋結(jié)構(gòu)的極重要的轉(zhuǎn)錄因子，普遍存在于胚胎組織中，能夠控制細(xì)胞分化、增殖，并在代謝動態(tài)平衡、生物個體發(fā)育、腫瘤發(fā)病進(jìn)展等方面起重要作用[5]。 研究發(fā)現(xiàn)[6]，F(xiàn)OXA2 表達(dá)水平與肺癌細(xì)胞的侵襲遷移能力呈負(fù)相關(guān)，F(xiàn)OXA2 在G1 期（DNA 合成前期）、S 期（DNA合成期）、M 期（有絲分裂期）表達(dá)明顯增強(qiáng)，能夠介導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂期，F(xiàn)OXA2 功能缺失可能造成細(xì)胞分化受阻，導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變。研究顯示[7]，F(xiàn)OXA2 在肝細(xì)胞癌組織中水平呈現(xiàn)下降趨勢，F(xiàn)OXA2 具有抑制裸鼠體內(nèi)瘤體生長和肝癌HepG2細(xì)胞增殖的作用。 文獻(xiàn)報道[8]，F(xiàn)OXA2 呈陰性表達(dá)的肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌患者的預(yù)后較差，F(xiàn)OXA2 有望成為評估肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌預(yù)后的指標(biāo)之一。 資料提示[9]，上皮性卵巢癌組織中FOXA2 表達(dá)水平與FIGO 分期、 組織分化程度有關(guān)，F(xiàn)OXA2 陽性表達(dá)病人的5年死亡率明顯地低于FOXA2 陰性表達(dá)病人，F(xiàn)IGO 分期高和FOXA2 陰性表達(dá)是上皮性卵巢癌預(yù)后不良的危險因素。 本研究結(jié)果提示FOXA2 在肺腺癌中呈低表達(dá)， 其表達(dá)水平與組織分化程度、TNM 分期、 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后呈相關(guān)性，F(xiàn)OXA2 低表達(dá)與肺腺癌組織分化程度低、TNM分期高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預(yù)后不良有關(guān)。 分析其原因，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 （epithelial-mesenchymal transition，EMT） 是調(diào)控腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一，F(xiàn)OXA2 表達(dá)下調(diào)后可能促進(jìn)轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1） 誘 導(dǎo) 的EMT，加速肺腺癌進(jìn)展，導(dǎo)致患者預(yù)后不良。

ALK 是一種在細(xì)胞生物學(xué)行為方面具有重要作用的受體酪氨酸激酶， 可促進(jìn)細(xì)胞增殖、 分化等。 ALK 也是腫瘤的致癌驅(qū)動因子， 正常情況下ALK 多數(shù)在胚胎神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)， 異常情況下ALK 可表達(dá)于多種腫瘤組織中，如肝細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、多發(fā)性骨髓瘤等[10]。ALK最初發(fā)現(xiàn)于間變性大細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系中， 由位于5 號染色體的核質(zhì)蛋白基因融合了位于2 號染色體的ALK 受體酪氨酸激酶而產(chǎn)生， 間變性大細(xì)胞淋巴瘤伴ALK 高表達(dá)的患者5年生存期較ALK 低表達(dá)患者更短[11]。 研究發(fā)現(xiàn)[12]，ALK 在高級別 （Ⅲ、 Ⅳ級） 的膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平較低級別（Ⅰ、Ⅱ級）更高。 文獻(xiàn)顯示[13]，ALK 陽性程度越高，神經(jīng)母細(xì)胞瘤侵襲能力越強(qiáng)，病人的預(yù)后較差。 研究證實[14]，ALK 融合基因突變會引發(fā)肺癌，給予ALK 酪氨酸激酶抑制劑干預(yù)后能夠快速消退腫瘤。報道顯示[15]，ALK 在無吸煙史、低分化患者中的表達(dá)率明顯高于有吸煙史、高/中分化患者，然后在Spearman 相關(guān)性分析中發(fā)現(xiàn)ALK 與表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）呈負(fù)相關(guān)。本研究中，肺腺癌組織中ALK 陽性表達(dá)率較正常肺組織顯著增加， 提示ALK 在肺腺癌中呈高表達(dá)；不同性別、腫瘤直徑、年齡、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺腺癌患者癌組織中ALK 表達(dá)水平差別不明顯， 組織分化程度不同的肺腺癌患者癌組織中ALK 表達(dá)水平差別明顯，提示ALK 表達(dá)水平與肺腺癌患者性別、腫瘤直徑、年齡、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)， 而與患者組織分化程度有關(guān)；ALK陰性表達(dá)患者的3年生存率較ALK 陽性表達(dá)患者顯著升高， 提示ALK 高表達(dá)與肺腺癌患者預(yù)后不良有關(guān)。 原因可能是， 磷脂酰肌醇3 激酶（Phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）/絲蘇氨酸蛋白激酶（serine-threonine kinase，AKT） 信號通路是一條與細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、腫瘤血管生成相關(guān)的極為重要的信號通路， 在癌癥發(fā)病過程中發(fā)揮十分關(guān)鍵的作用，ALK 可能通過上調(diào)PI3K/AKT 信號通路而促進(jìn)肺腺癌增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移，進(jìn)而導(dǎo)致患者預(yù)后差。

綜上所述，F(xiàn)OXA2 在肺腺癌中呈低表達(dá)，ALK在肺腺癌中呈高表達(dá)，F(xiàn)OXA2 與肺腺癌組織分化程度、TNM 分期、 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后呈相關(guān)性，ALK 與肺腺癌組織分化程度及預(yù)后呈相關(guān)性。 但本研究具有樣本量小、隨訪時間短、研究方法有限等不足，因此還需進(jìn)一步研究證實。