IL-20 在房顫患者表達升高并調控膠原沉積

束穎

（河南省周口市中心醫院急診科，河南 周口 466000）

心房顫動(AF) 是臨床上最常見的心律失常之一，其發病率會隨著年齡增大而逐漸增加，60 歲以上人群發病率可達到12%[1-2]。 AF 可引起嚴重的臨床后果，包括心功能下降和腦卒中，嚴重者可導致心力衰竭和死亡[3]。近年來，越來越多的AF 患者從藥物治療和手術治療中獲益，但AF 患者的總體預后仍然較差，尤其是老年患者[3-4]。 因此，尋找有效的干預靶點以預防AF 的進展具有重大的臨床意義和社會價值。

白細胞介素20（IL-20）是一種小分子量的分泌蛋白， 于2001年被美國Chandrasekher 教授發現，屬于IL-10 家族[5]。 IL-20 通常作為一個單體存在，可表達于多種免疫細胞和非免疫細胞，包括巨噬細胞、樹突狀細胞、心肌細胞和平滑肌細胞等，但在免疫細胞中表達尤為明顯[6-9]。IL-20 的受體是由IL-20Rα 和IL-20Rβ 構成的異二聚體， 并廣泛存在于多種器官和組織表面[5]。 IL-20 可以與靶細胞上的受體結合并激活STAT3、p38 和JNK 信號通路參與下游信號的調控，其中STAT3 通路是IL-20 最主要的信號通路[10-11]。 IL-20 可以調控多種生物學效應，包括生長發育、炎癥反應、氧化應激、自噬和凋亡等， 并可參與多個系統疾病的進程[5,10,12-14]。

大量的研究證實，IL-20 與心腦血管疾病密切相關。 在高脂飲食喂養的雄性載脂蛋白E 敲除(ApoE-/-) 小鼠和缺氧誘導的腦卒中小鼠模型中，IL-20 的表達顯著增高[15-17]。此外，在高脂飲食介導的ApoE-/-動脈粥樣硬化小鼠模型中，給予重組小鼠IL-20 (rIL-20) 顯著地促進其進程并放大炎癥反應，并且IL-20 是動脈粥樣硬化發展進程中的重要啟動因素[17-19]。 然而，IL-20 在AF 中的表達和作用未知，這個研究的目的是檢測IL-20 在AF 患者中的表達并探討IL-20 參與AF 進程的可能機制。

1 材料和方法

1.1 血液標本的收集 本實驗的研究人群為竇性心律患者和AF 患者。 納入標準為：連續就診于本科室的AF 患者。 排除標準為：患有影響IL-20 表達疾病的患者，包括慢性腎衰竭、慢性心力衰竭、腫瘤、冠心病、結締組織疾病、其他心律失常、膿毒癥和其他急性或慢行炎癥性疾病等。

血液標本的收集分為2 個階段。 第一階段從2016年10月至2017年11月， 收集永久性AF 患者血液標本(n=78)，竇性心律患者血液標本(n=60)作為對照。 分離每個血液樣本中的CD4+T 淋巴細胞、 巨噬細胞和樹突狀細胞用于IL-20 mRNA 檢測。 第二階段從2017年12月至2019年4月，收集陣發性AF 患者(n=45), 持續性AF 患者(n=60)和永久性AF 患者(n=70)血液樣本、竇性心律患者血液標本(n=62)作為對照。 分離每個血液樣本中的血漿，用于檢測IL-20 和TGF-β1 水平。其中，陣發性AF、持續性AF 和永久性AF 根據既往的文獻進行劃分[20]。

所有的血液樣本均在河南省周口市中心醫院急診科收集，由臨床經驗超過5年的護士完成。 血液標本收集之前， 已告知患者及其家屬樣本僅用于科學研究，且患者或其家屬簽署知情同意。

1.2 方法

1.2.1 免疫細胞的分離 血液標本中免疫細胞的分離根據既往文獻的描述完成[20]。 大致方法如下：每個血液標本中分別加入紅細胞裂解液 (0.5 mL 紅細胞裂解液/1 mL 血液樣本, Servicebio) 裂解紅細胞， 以Ficoll 密度梯度分離外周血單核細胞(PMBCs)。 使用磷酸鹽緩沖液(PBS) 漂洗PMBCs 2 次，分別使用抗人CD4 和CD11b (Miltenyi Biotech) 陽性磁珠選擇和分離樣本中的CD4+T 淋巴細胞和單核細胞。 CD4+T 淋巴細胞給予人抗CD3 (1μg/mL，eBioscience)和人抗CD28 (1μg/mL，eBioscience)刺激其成熟[21]，單核細胞給予人巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF, 50 ng/mL, PeproTech)或人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF, 50 ng/mL, Pepro-Tech)刺激其向巨噬細胞和樹突狀細胞分化[20]。

1.2.2 實時聚合酶鏈反應分析(TR-qPCR) 1.5 mL EP 管分別收集實驗所需細胞， 每管中加入1 mL TRIzol 試劑(Invitrogen)分別對這些細胞進行裂解后， 收集各細胞的總mRNA。 使用逆轉錄試劑盒(Roche) 將總mRNA 轉錄為cDNA， 使用LightCycler 480 SYBR Green Master Mix (Roche) 進行PCR擴增，并進行靶基因mRNA 的檢測，基因的表達使用GAPDH 進行標準化。 所有的樣本均重復3 次，其平均值即為目的表達。 本實驗中，CD4+T 淋巴細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞中IL-20 mRNA 表達被檢測，心臟成纖維細胞中α-SMA、膠原蛋白I (Collagen I)和膠原蛋白III (Collagen III) mRNA 表達水平被檢測，RT-qPCR 引物序列，見表1。

表1 RT-qPCR 引物序列

1.2.3 酶聯免疫吸附測定(ELISA) 血液樣本在采集完成后被迅速轉移至實驗室， 所有樣品在4°C條件下5 000×g 離心10 min，收集上清液(即血漿)后于-80°C 保存， 待進一步檢測。 整個過程在45 min 內完成。

人IL-20 ELISA 試劑盒和人TGF-β ELISA 購自Thermo Fisher Scientific 公司。血漿樣本從-80°C環境中取出并在4°C 環境中解凍， 然后用樣品稀釋液稀釋血漿樣品，根據廠家提供的說明書，用上述ELISA 試劑盒檢測每個血漿樣品中IL-20 和TGF-β1 的水平。 每個樣本重復檢測2 次。

1.2.4 細胞實驗 小鼠心肌成纖維細胞購于Scien-Cell 研究 實 驗 室， 在 含 有10% FBS (Gibco)的DMEM/F12 培養液(Gibco) 中培養和傳代。 第5 代的細胞用于本實驗，并被分成8 個組，在不含FBS的DMEM/F12 培養液培養12 h 后，各組細胞如下刺激：1. 溶劑 (二甲基亞砜，DMSO， Sigma); 2. 重組小鼠IL-20 (rIL-20，200 ng/mL, PeproTech)[22];3. S31-201 (50 μg/mL，Sigma)[23]; 4. rIL-20 + S31-201; 5. TGF-β1 (10ng/mL; PeproTech)[20]; 6. TGFβ1 + IL-20; 7. TGF-β1 + S31-201; 8. TGF-β1 +rIL-20 + S31-201。 每8 h 更換培養液一次， 刺激24 h 后收集細胞，按照上述方法檢測α-SMA、Collagen I 和Collagen III mRNA 表達水平。

1.3 統計學分析 采用SPSS 23.0 對所有數據進行分析。 連續變量用（±s）表示，使用未配對t 檢驗分析兩組之間的差異，one-way ANOVA 和隨后進行Tukey’s 檢驗分析三組或更多組之間的差異。 分類變量以百分比表示， 使用Fisher 檢驗進行比較。IL-20 表達和TGF-β1 表達相關性使用Spearman相關分析。 通過線性回歸來分析IL-20 是否與AF的發生有關。 P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基本臨床特征 第一階段患者：與竇性心律患者相比，永久性AF 患者AF 持續時間增加，左心房內徑增大，其他臨床特征無顯著差異，包括年齡、性別、體重指數、抽煙、飲酒、高血壓、糖尿病、基礎心臟病、病變的瓣膜、左心室內徑和左心室射血分數。 各組臨床特征，見表2。 第二階段患者： AF 持續時間在陣發性AF 組、持續性AF 組和永久性AF組中逐步增高，且均比竇性心律患者延長。 此外，竇性心律組、 陣發性AF 組和持續性AF 組左心房內徑和左心室內徑無顯著差異， 且均小于永久性AF 組。其他臨床特征在4 組間無顯著差異。各組臨床特征見表3。

表2 竇性心律者和房顫患者臨床特征

表3 非AF 者和AF 患者的臨床特征

2.2 AF 患者巨噬細胞中IL-20 mRNA 表達顯著升高 RT-qPCR 結果顯示，AF 患者巨噬細胞中IL-20 mRNA 的表達比竇性心律患者巨噬細胞中增加了約2.9 倍，見圖1B。 竇性心律患者和永久性AF患者CD4+T 淋巴細胞和樹突狀細胞中IL-20 mRNA 水平無顯著差異，見圖1A—圖1C。

圖1 AF 患者IL-20 mRNA 表達

2.3 AF 患者血漿IL-20 水平顯著升高 ELISA 的結果表明，血漿IL-20 水平在陣發性AF 組、持續性AF 組和永久性AF 組中逐步增加， 且均顯著高于竇性心律患者，見圖2A。血漿TGF-β1 水平表現出與IL-20 相似的趨勢，見圖2B。Spearman's 相關性分析顯示AF 患者中血漿IL-20 水平和TGF-β1水平正相關，見圖2C。 根據有無老年、男性、超重、抽煙、飲酒、高血壓或糖尿病，AF 患者被分成2 組，結果表明合并有抽煙、飲酒、高血壓或糖尿病的AF患者表現出更高的IL-20 水平，各組樣本量、IL-20水平和P 值，見表4。

表4 臨床因素對IL-20 表達的影響

圖2 AF 患者循環IL-20 和TGF-β1 水平

2.4 IL-20 與AF 的發生獨立相關 為明確IL-20與AF 發生的關系，IL-20 水平、TGF-β1 水平、老年、男性、超重、抽煙、飲酒、高血壓、糖尿病和左房內徑等變量用來進行單因素回歸分析， 結果顯示IL-20 水平、TGF-β1 水平、抽煙、飲酒、高血壓、糖尿病表現出趨勢，即可能和AF 的發生相關。 這些變量被用來進行多元回歸分析， 結果顯示，IL-20、TGF-β1、抽煙、高血壓、糖尿病均與AF 的發生獨立相關。 各變量的β 值、95%CI、P 值，見表5。

表5 通過單變量分析和隨后的多變量線性回歸分析評估血清IL-20 和AF 發生的關系

2.5 rIL-20 處理增加TGF-β1 介導的心臟成纖維細胞膠原沉積 在體外實驗中，TGF-β1 處理顯著增加了小鼠成纖維細胞α-SMA、Collagen I 和Collagen III mRNA 的表達， 給予rIL-20 進一步增加這些纖維化標志物mRNA 表達， 使用S31-201 顯著的逆轉rIL-20 對成纖維細胞的調控作用。 而在未給予TGF-β1 處理的小鼠成纖維細胞中，rIL-20和S31-201 對成纖維細胞膠原沉積無顯著影響，見圖3。

圖3 IL-20 對膠原合成的影響

3 討論

在本研究中，我們檢測了IL-20 在AF 患者中的表達，結果表明AF 患者巨噬細胞中IL-20 mRNA 的表達水平顯著增高， 表明AF 患者中巨噬細胞可能是IL-20 的主要來源。 此外，循環IL-20 在AF 患者中增高，并且和TGF-β1 水平正相關，多種臨床特征如抽煙、飲酒、高血壓和糖尿病可以影響IL-20 的分泌， 回歸分析結果表明IL-20 可能和AF 的發生獨立相關。 在體外實驗中，rIL-20 顯著增加TGF-β1 介導的膠原沉積， 這種作用可以被S31-201 逆轉。

AF 的發病機制十分復雜，包括炎癥反應、氧化應激等多種病理因素均參與其進程， 其中炎癥反應發揮至關重要的作用[24-26]。IL 成員可以通過調控炎癥反應參與多種心血管疾病， 且多個成員被證實與AF 相關。 Gungor 等人報道，IL-1 受體拮抗基因等位基因2 多態性與人孤立性AF 的發生密切相關[27]。 IL-2 在AF 患者中顯著升高，與低IL-2 水平組相比，高IL-2 水平組的預后較差[28]。 而IL-6 -174G/C 基因多態性顯著地增加冠狀動脈搭橋術后AF 的發生率[29]。此外，降低循環IL-17 水平和升高循環IL-17 水平分別可以降低和升高AF 發生和復發率[30-31]。 IL-27 基因rs153109 多態性的G等位基因和GG 基因型顯著提高了中國漢族人群的AF 易感性[32]。 近期的研究發現，IL-22 在AF 患者血漿和心房組織均升高，并且和AF 的發生獨立相關[20]。 而本研究發現循環IL-20 水平在AF 患者中升高，線性回歸結果表明IL-20 可能和AF 的發生獨立相關， 這提示IL-20 可能參與AF 的發生，也是對IL 和AF 相關性的進一步補充和完善。 此外，AF 患者巨噬細胞中IL-20 mRNA 表達顯著增高，表明在AF 中巨噬細胞可能是IL-20 來源。 巨噬細胞是一類重要的免疫細胞， 可以介導強烈的免疫反應并釋放多種炎癥物質，表明IL-20 可能是通過調控炎癥反應參與AF 進程。

在人和動物AF 心房組織中可以觀察到心房重構和心房纖維化。 有研究證實，延緩心房重構可以顯著減少AF 的發生率和并縮短AF 持續時間[20,32]。近期發表的一項長期臨床隨訪研究顯示， 延緩心房纖維化顯著增加AF 射頻消融術的成功率并減少復發率， 提示心房纖維化引起的電重構可能是房顫發生發展的主要原因[33]。 事實上，越來越多的研究關注心房纖維化作為心房阻滯的機制， 動物研究和臨床實驗數據顯示， 嚴重的心房纖維化會導致AF 的發生率和持續時間增加；此外，抑制心房纖維化顯著抑制AF 的發生和進展的假說已經越來越被接受[34-36]。 這表明，病理因素可能導致心房重構，包括心房結構改變和心房纖維化，心房電重構最終導致AF 的發生和發展，提示心房纖維化是AF 最直接的發病機制。 而在本研究中，我們發現AF 患者IL-20 水平和TGF-β1 水平呈正相關，表明IL-20 可能是通過調控心房纖維化參與AF進程。

IL-20 是一種多功能的細胞因子，已被證實參與多種生物學效應。 越來越多的研究表明，IL-20與纖維化的進程密切相關，其中中和或下調IL-20表達分別可以減少硬皮病中皮膚纖維化或肝纖維化，而增加IL-20 表達可以加劇慢性腎衰竭介導的腎纖維化[22,37-38]。 這表明IL-20 可以影響多種器官或組織的纖維化進程， 盡管其在心肌纖維化中的作用暫未見報道。 為了探討IL-20 參與AF 可能的機制，我們檢測IL-20 對TGF-β1 介導的小鼠心臟成纖維細胞膠原沉積的影響， 結果表明rIL-20 處理進一步增加成纖維細胞膠原沉積，提示IL-20 可以通過加重心房纖維化加速AF 進程。STAT3 通路是IL-20 最主要的信號通路，并且與心房纖維化和AF 的發生密切相關[39-40]。 為了進一步探討機制，我們使用特異性的STAT3 通路抑制劑S31-201 進行干預，結果顯示IL-20 對成纖維細胞膠原沉積的作用被S31-201 顯著逆轉。 這些結果表明，IL-20 可能是通過激活STAT3 通路， 加重心房重構和心房纖維化，進而調控AF 進程。

總之， 這個研究發現在AF 患者中IL-20 增高， 并且初步闡明IL-20 參與AF 進程可能的機制。 但具體的機制仍不明確，需要動物實驗進一步明確。