RhoA/ROCK-NFκB信號(hào)傳導(dǎo)通路在內(nèi)脂素引起心肌細(xì)胞肥大中的作用

常亮 楊蓉 劉素云 李擁軍

心肌肥大指心臟為適應(yīng)機(jī)體做功的不斷增加而發(fā)生的適應(yīng)性反應(yīng)，這種反應(yīng)具有一定的代償效果，能夠維持甚至增加心輸出量，但隨著心肌肥大的發(fā)展，心肌氧耗量也會(huì)進(jìn)一步增加，“代償性”肥大終將發(fā)展為“失代償性”心肌肥厚并出現(xiàn)心力衰竭。心肌肥大是高血壓、冠心病、心肌病等多種心血管疾病的共同病理生理變化,發(fā)生發(fā)展涉及到諸多因素,機(jī)制尚未完全闡明。脂肪細(xì)胞因子是由脂肪組織分泌的一種血管活性物質(zhì)，包括瘦素、腫瘤壞死因子、抵抗素、脂聯(lián)素、白細(xì)胞介素等。內(nèi)脂素是新近發(fā)現(xiàn)的一種脂肪細(xì)胞因子，具有促炎、促動(dòng)脈粥樣硬化及降低斑塊穩(wěn)定性等多種作用，是冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1]。近年有研究發(fā)現(xiàn)，血清脂聯(lián)素、內(nèi)脂素可作為臨床預(yù)測(cè)PCI術(shù)后發(fā)生心力衰竭的指標(biāo)[2]。但目有關(guān)內(nèi)脂素在心肌細(xì)胞肥大過(guò)程中的作用研究較少。本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，觀察內(nèi)脂素對(duì)心肌細(xì)胞肥大的影響及相關(guān)機(jī)制，結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)2～3 d日齡SD乳鼠，雌雄不限，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑 多聚甲醛、辛伐他汀，美國(guó)Sigma公司；重組大鼠內(nèi)脂素，Abcam公司;多聚-L-賴氨酸，Amresco公司；SP免疫組化試劑盒,美國(guó)ZYMED公司;DMEM培養(yǎng)基，GIBCO公司白酶干粉，Hyclone公司；胎牛血清，北京索來(lái)寶公司；雙抗Invitrogen公司；5-溴脫尿苷，美國(guó)santa cruz公司；總RNA 提取試劑(Trizol),北京SBS公司；ROCK2，RhoA，Iκbα，p65，SIRT1兔抗鼠一抗及FK866、SN50、Y27632，美國(guó)santa cruz公司BNP兔抗鼠一抗，美國(guó)Abcam公司；瓊脂糖凝膠，北京北方同正生物技術(shù)發(fā)展有限公司。

1.3 主要儀器 倒置顯微鏡，日本尼康公司；無(wú)菌潔凈工作臺(tái)，北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠；THZ-C臺(tái)式恒溫振蕩器，江蘇省太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；TGL-16B高速臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；ABI StepOne熒光定量PCR儀，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)(ABI)公司； GDS-8000 凝膠成像分析系統(tǒng)，美國(guó)UVP 公司。

1.4 研究方法

1.4.1 心肌細(xì)胞提取及培養(yǎng):在無(wú)菌條件下，取2～3 d日齡SD乳鼠的心臟，取心尖區(qū)心室肌剪碎，用混合消化酶于37℃恒溫振蕩進(jìn)行反復(fù)短時(shí)間的多次消化，每次消化后加入含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀。結(jié)束消化過(guò)程后，收集離心后的心肌細(xì)胞，充分重懸、過(guò)濾，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中，置于含5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)90 min。參照文獻(xiàn)利用差速貼壁法分離出心肌細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液，常規(guī)使用5-BrdU抑制成纖維細(xì)胞的干擾[3]。

1.4.2 分組及干預(yù)方法:常規(guī)進(jìn)行心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)48 h后，換為無(wú)血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，之后將六孔板上的細(xì)胞每6孔分為一組，換培養(yǎng)基的同時(shí)進(jìn)行分組及干預(yù)。①正常對(duì)照組，10、50、100 ng/ml重組內(nèi)脂素，分別干預(yù)24 h；②正常對(duì)照組，重組內(nèi)脂素100 ng/ml分別干預(yù)12 h、24 h、48 h、72 h；③正常對(duì)照組、重組內(nèi)脂素100 ng/ml干預(yù)組、SN50(20 μmol/L)組、SN50(20 μmol/L)組+重組內(nèi)脂素100 ng/ml組，分別干預(yù)48 h；④正常對(duì)照組、重組內(nèi)脂素100 ng/ml、Y27632(10 μmol/L)組、Y27632(10 μmol/L) +重組內(nèi)脂素100 ng/ml、辛伐他汀組(1 μmol/L)、辛伐他汀(1 μmol/L)+重組內(nèi)脂素100 ng/ml，分別干預(yù)48 h。

1.4.3 Real-time PCR法檢測(cè)

1.4.3.1 心肌細(xì)胞總RNA提取及cDNA第一鏈合成:分別吸取細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)液，每細(xì)胞培養(yǎng)孔中加入1 ml Triozol，按照Trizol總RNA抽提試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行心肌細(xì)胞總RNA 的提取，用分光光度計(jì)測(cè)定所抽提RNA 的濃度和純度，使用前調(diào)整總RNA濃度為1 μg/μl。取上述總RNA 1～5 μg，按照說(shuō)明書進(jìn)行cDNA 合成。

1.4.3.2 Real-time PCR反應(yīng):取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)。按以下體系進(jìn)行real time PCR反應(yīng):2×ALL-in-One qPCR Mix 10 μl，ALL-in-One qPCR primer 2 μl，1st strand cDNA(5倍稀釋液)2 μl，50×Rox Reference Dye 0.4 μl ddH2O 5.6 μl，F(xiàn)inal Volume 20 μl。反應(yīng)條件:95℃ 10 s;60℃ 20 s;72℃ 15 s，共40個(gè)循環(huán)。PCR 產(chǎn)物分析，行3%瓊脂糖凝膠電泳反應(yīng)，結(jié)束后行融解曲線分析。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用相對(duì)定量2-ΔΔCt計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。各檢測(cè)基因引物序列均由美國(guó)復(fù)能基因公司提供。

1.4.4 Western blot 法檢測(cè):收集胰酶消化的心肌細(xì)胞，冰上裂解細(xì)胞并抽提蛋白，BCA試劑盒定量，煮沸變性后加至上樣孔中，進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳，染色，然后轉(zhuǎn)印至PVDF 膜，封閉液室溫封閉1 h，加相應(yīng)抗體4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜，加相應(yīng)二抗室溫雜交，TBST洗膜,ECL顯色，曝光，顯影，定影。使用GDS-8000 凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量，結(jié)果以GAPDH為內(nèi)參。

1.4.5 免疫細(xì)胞化學(xué)檢:NFκB核轉(zhuǎn)位情況 常規(guī)細(xì)胞爬片固定,參照免疫組化SP法說(shuō)明書免疫組化,DAB 顯色,在倒置顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.4.6 心肌細(xì)胞表面積測(cè)定 心肌細(xì)胞以1×104個(gè)/cm2密度種植于24孔板內(nèi)，按照實(shí)驗(yàn)方法處理細(xì)胞，Nikon倒置顯微鏡下采集圖像，隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野選取10個(gè)細(xì)胞，采用Image-Pro Plus圖像分析軟件檢測(cè)細(xì)胞表面積，取均值。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度內(nèi)脂素對(duì)心肌細(xì)胞RhoA、ROCK2及IκB-α蛋白表達(dá)的影響 與正常對(duì)照組比較，10 ng/ml，50 ng/ml和100 ng/ml內(nèi)脂素預(yù)處理24 h的心肌細(xì)胞中，RhoA, ROCK2蛋白表達(dá)升高，IκB-α蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。與正常對(duì)照組比較，100 ng/ml內(nèi)脂素預(yù)處理24、48、72 h的心肌細(xì)胞中，RhoA ROCK2 蛋白表達(dá)升高，IκB-α蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。即隨著內(nèi)脂素干預(yù)濃度的增加和干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，心肌細(xì)胞RhoA和ROCK2蛋白水平隨之升高，100 ng/ml內(nèi)脂素干預(yù)48 h最高；IκB-α蛋白水平降低，100 ng/ml內(nèi)脂素干預(yù)48 h最低。見表1、2。

表1 不同濃度內(nèi)脂素對(duì)心肌細(xì)胞RhoA、ROCK2及IκB-α蛋白表達(dá)的影響

表2 100 ng/ml內(nèi)脂素不同作用時(shí)間對(duì)心肌細(xì)胞RhoA、ROCK2及IκB-α蛋白表達(dá)的影響

2.2 SN50、Y27632和辛伐他汀對(duì)心肌細(xì)胞表面積及BNP mRNA、蛋白水平的影響 SN50+內(nèi)脂素、辛伐他汀+內(nèi)脂素、Y27632+內(nèi)脂素預(yù)處理48 h的心肌細(xì)胞表面積，BNP mRNA和蛋白表達(dá)與內(nèi)脂素干預(yù)比較降低(P<0.05)，與正常對(duì)照組比較升高(P<0.05)。加用辛伐他汀+內(nèi)脂素、Y27632+內(nèi)脂素和SN50+內(nèi)脂素干預(yù)的心肌細(xì)胞細(xì)胞表面積，BNP mRNA和蛋白水平均明顯低于單純的內(nèi)脂素干預(yù)組(P<0.05)，但高于正常對(duì)照組(P<0.05)。細(xì)胞免疫組化觀察，與正常對(duì)照組相比，100 ng/ml內(nèi)脂素干預(yù)48 h組心肌細(xì)胞大量NFκB p65從胞漿轉(zhuǎn)位至胞核中。見表3、4，圖1。

表3 SN50對(duì)心肌細(xì)胞表面積及BNP mRNA、蛋白水平的影響

表4 Y27632和辛伐他汀對(duì)心肌細(xì)胞表面積及BNP mRNA、蛋白水平的影響

圖1 內(nèi)脂素對(duì)心肌細(xì)胞中NFκBp65位置的影響(免疫組化×200)

2.3 RhoA/ROCK2和NFκB的關(guān)系 與單純內(nèi)脂素干預(yù)組比較，辛伐他汀+內(nèi)脂素和Y27632+內(nèi)脂素干預(yù)組心肌細(xì)胞ROCK2蛋白水平明顯低于內(nèi)脂素干預(yù)組(P<0.01)，IκB-α蛋白水平明顯升高(P<0.01)，但與正常對(duì)照組比較無(wú)明顯差異(P>0.05)；SN50+內(nèi)脂素干預(yù)組心肌細(xì)胞ROCK2蛋白水平高于正常對(duì)照組(P<0.01)，與內(nèi)脂素干預(yù)組比較無(wú)明顯差異(P>0.05)；IκB-α蛋白水平明顯高于內(nèi)脂素干預(yù)組(P<0.01)，較正常對(duì)照組沒有明顯差異(P>0.05)。細(xì)胞免疫組化結(jié)果顯示，辛伐他汀+內(nèi)脂素和Y27632辛伐他汀+內(nèi)脂素干預(yù)組NFκB p65核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象較之內(nèi)脂素干預(yù)組明顯減少。見表5，圖2。

表5 辛伐他汀、Y27632和SN50對(duì)心肌細(xì)胞ROCK2、IκB-α蛋白表達(dá)的影響

圖2 RhoA/ROCK2和NFκb信號(hào)抑制劑對(duì)心肌細(xì)胞NFκbp65定位的影響(免疫組化×200)

3 討論

內(nèi)脂素可以促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞成熟并能致血管重構(gòu)，調(diào)節(jié)脂肪代謝，參與動(dòng)脈粥樣硬化的病理過(guò)程[4]。本研究前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大中，內(nèi)脂素表達(dá)在一定范圍內(nèi)隨Ang Ⅱ刺激濃度和時(shí)間的增加而增高，且外源性的內(nèi)脂素可以獨(dú)立引起心肌細(xì)胞肥大[5]。

NFκB是一種至關(guān)重要的細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)如免疫炎癥、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞殖和分化相關(guān)基因等多種基因的表達(dá)[6]。另外，NFκB在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)中也發(fā)揮重要作用。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，NFκB信號(hào)傳導(dǎo)通路在心肌細(xì)胞肥大的病理過(guò)程中有著重要的作用[7,8]。NFκB可以被多種脂肪細(xì)胞因子激活，如TNFs、瘦素和內(nèi)脂素，進(jìn)而促進(jìn)NFκB進(jìn)入細(xì)胞核，激活一系列細(xì)胞炎癥、生長(zhǎng)和存活所需基因的表達(dá)，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大[9]。NFκB抑制蛋白(IκB)是調(diào)節(jié)NFκB的激活及轉(zhuǎn)錄的重要蛋白。目前研究認(rèn)為，IκBα是IκB家族中的重要成員，是IκB 家族中降解速度最快，抑制NFκB活性的最重要成分[10]。在靜息狀態(tài)下，IκBα與NF-κB 雜二聚體以結(jié)合形式位于細(xì)胞質(zhì)中，抑制NFκB 活化。當(dāng)各種刺激因子如脂多糖、病毒蛋白等刺激細(xì)胞時(shí)，級(jí)聯(lián)信號(hào)速激活I(lǐng)κB 激酶復(fù)合物，導(dǎo)致IκBα磷酸化、降解，促進(jìn)NFκB 磷酸化、核轉(zhuǎn)錄，進(jìn)入細(xì)胞核[9]。BNP屬利鈉肽家族的成員,主要在心室的心肌細(xì)胞合成,是左心室心肌肥厚和心功能不全的強(qiáng)預(yù)測(cè)因子，動(dòng)物離體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在心肌細(xì)胞的肥大過(guò)程中,BNP 水平可持續(xù)分泌。本研究顯示，在內(nèi)脂素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大過(guò)程中，隨著內(nèi)脂素濃度的升高和干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，IκBα蛋白水平降低；細(xì)胞免疫組化檢測(cè)顯示，在內(nèi)脂素的干預(yù)下，NFκB出現(xiàn)了明顯的核轉(zhuǎn)位。而用NFκB信號(hào)通路特異性阻斷劑SN50阻斷NFκB信號(hào)通路后，內(nèi)脂素的作用下的心肌細(xì)胞細(xì)胞表面積和BNP蛋白水平均顯著降低，NFκB未出現(xiàn)明顯的核轉(zhuǎn)位。以上研究結(jié)果說(shuō)明，NFκB信號(hào)傳導(dǎo)通路與內(nèi)脂素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大密切相關(guān)，內(nèi)脂素通過(guò)NFκB信號(hào)通路引起心肌細(xì)胞肥大。

研究顯示，小G 蛋白超家族，尤其是其亞家族成員RhoA及其下游信號(hào)分子ROCK，是參與心肌肥大重塑的重要信號(hào)通路。RhoA/ROCK 可能通過(guò)激活ERK1/2-GATA 通路促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大。王麗君RhoA 基因沉默能夠抑制RhoA 的活性，從而阻止心肌細(xì)胞肥大進(jìn)程[11]。RhoA是Rho 3個(gè)亞型中研究最多的一個(gè)；ROCK是與細(xì)胞凋亡相關(guān)的激酶，有ROCKl和ROCK2 2個(gè)亞型，二者在人類心血管系統(tǒng)中廣泛表達(dá)[12]。高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大伴有RhoA的激活，抑制RhoA活性可對(duì)抗心肌細(xì)胞肥大[13]。靜息狀態(tài)下的ROCK沒有酶活性，在成年大鼠心肌細(xì)胞中，壓力過(guò)度負(fù)荷可以引起ROCK的快速激活[14]。心肌梗死后伴有心肌細(xì)胞肥大，ROCK激酶抑制劑法舒地爾及辛伐他丁能抑制Rho/Rock信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性,進(jìn)而抑制這種肥大[15,16]。說(shuō)明ROCK在心肌梗死后的心臟重構(gòu)中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞RhoA和ROCK2蛋白水平隨著內(nèi)脂素干預(yù)濃度和干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，證實(shí)RhoA 及其激酶ROCK 是內(nèi)脂素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要環(huán)節(jié)。辛伐他汀為RhoA特異性抑制劑，Y-27632為嘧啶衍生物,是一種近年來(lái)合成的特異性ROCK抑制劑[17]。本研究分別應(yīng)用辛伐他汀和Y27632阻斷預(yù)干預(yù)，發(fā)現(xiàn)在辛伐他汀和Y27632的預(yù)干預(yù)后，內(nèi)脂素作用下的心肌細(xì)胞細(xì)胞表面積及BNP mRNA和蛋白水平均顯著降低。證明內(nèi)脂素通過(guò)RhoA/ROCK信號(hào)通路引起心肌細(xì)胞肥大，應(yīng)用RhoA/ROCK信號(hào)通路抑制劑可能抑制心肌肥大。

NFκB作為ROCK的另一下游信號(hào)分子，同時(shí)也是調(diào)控各種炎性因子分泌的重要轉(zhuǎn)錄因子之一。研究表明，腫瘤NFκB的激活可以通過(guò)抑制Rho-NFκB得到抑制，提示Rho/ROCK可以調(diào)控NFκB的活化[18]。ROCK1與RhoB能夠協(xié)同激活NFκB，且通過(guò)遺傳或抑制劑抑制ROCK-I的活性可阻斷NFκB的激活。溶血磷脂酸(LPA)是RhoA/Rho激酶信號(hào)通路的有效激活劑，ROCK2通過(guò)激活人內(nèi)皮細(xì)胞中的NFκB途徑促進(jìn)LPA誘導(dǎo)的CAM表達(dá)[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀和Y27632預(yù)干預(yù)后，在內(nèi)脂素作用下心肌細(xì)胞的，ROCK2蛋白水平明顯降低；而NFκB抑制蛋白IκBα蛋白水平未見明顯降低，未見明顯NFκB核轉(zhuǎn)位，提示IκBα蛋白磷酸化和降解得到抑制。以上結(jié)果證實(shí)，辛伐他汀和Y27632能阻斷RhoA/ROCK及下游信號(hào)NFκB通路。進(jìn)一步應(yīng)用NFκB抑制劑SN50干預(yù)心肌細(xì)胞，結(jié)果顯示，IκBα蛋白水平較正常對(duì)照組無(wú)明顯變化，細(xì)胞免疫組化也未見明顯的NFκB核轉(zhuǎn)位。這一結(jié)果證明，SN50能夠阻斷心肌肥大過(guò)程中 NFκB信號(hào)通路。綜合上分析認(rèn)為，在內(nèi)脂素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大中，NFκB為RhoA/ROCK信號(hào)通路的下游信號(hào)通路。

本研究初步證實(shí)，RhoA/ROCK-NFκB信號(hào)通路在內(nèi)脂素引起的心肌細(xì)胞肥大過(guò)程中發(fā)揮作用。