SIRT1 基因多態性與BMI 及酒精性肝病相關性的研究

侯葉廷，牛海靜，安彩艷，史麗芳，格日勒，武艷芳

（1.內蒙古醫科大學附屬醫院 消化內科，內蒙古 呼和浩特 010050；2.內蒙古醫科大學附屬醫院 臨床醫學研究中心，內蒙古 呼和浩特 010050）

酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）由于高發病率、高死亡率，成為全世界備受關注的公共衛生問題，我國ALD 的發生率逐年上升，嚴重危害人民健康。研究ALD 的發病機制，有利于ALD 的防治。飲酒量、飲酒頻率、飲酒種類等影響因素相同的條件下，不同個體對酒精性肝病的易感性不同，很大程度取決于遺傳易感性，因此，酒精性肝病基因多態性相關研究成為熱點。沉默信息調節因子1（SIRT1）廣泛參與哺乳動物細胞壽命的多條信號通路以及糖、脂代謝、胰島素分泌等多條代謝通路的調控，具有調節機體能量代謝平衡，保持機體糖脂代謝穩態功能。一些動物研究已經發現：通過調節SIRT1 及SIRT1 相關信號通路，顯著改善酒精性肝損傷的程度［1-5］。因此，通過調節、干預SIRT1 及SIRT1 相關代謝途徑可以緩解酒精性肝病的程度，但具體的調節機制尚不明確。本研究以酒精性脂肪肝病為研究對象，與非酒精性脂肪肝、飲酒對照組、健康對照組對照研究，研究SIRT1基因多態性與BMI 及酒精性肝病的相關性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 倫理聲明 本研究通過內蒙古醫科大學附屬醫院倫理委員會批準，并遵照赫爾辛基宣言［6］，所有受試者簽署知情同意書。

1.1.2 研究對象 研究對象分成四組：（1）酒精性脂肪肝組（AFLD，n=176），日飲酒量折合酒精量大于40 g，飲酒年限大于5 年，脂肪肝的超聲診斷標準符合歐洲肝病學會［8］和美國肝病研究學會標準［9］；（2）非酒精性脂肪肝病組（NAFLD，n=117），無飲酒史，超聲診斷標準符合歐洲肝病學會［8］和美國肝病研究學會標準［9］；（3）飲酒對照組（n=92），日飲酒量大于40 g，飲酒年限大于5 年，無脂肪肝的證據；（4）健康對照組（n=120），無飲酒史，無脂肪肝證據，相關化驗檢查正常。

1.1.3 排除標準 本研究所有受試對象無肝細胞癌，有以下任何一項者，將從本研究中排除：（1）有乙肝表面抗原陽性，丙肝抗體陽性，艾滋病抗體陽性；（2）糖尿病患者；（3）其它原因導致的肝病（肝豆狀核變性，自身免疫性肝病，藥物誘發的肝病等）；（4）漢族以外的民族；（5）不愿意參與本研究的。

1.1.4 一般資料收集 符合入選標準的研究對象，詳細詢問病史，包括飲酒史、飲酒年限，既往病史等，收集性別、年齡、身高、體重，測定肝功能、血糖、血脂，填寫基礎數據表（表1）。

1.1.5 標本采集 受試對象空腹一夜后，抽取2 mL 外周靜脈血，血液標本EDTA 抗凝處理，3000 r/min 離心10 min，用DNA 工具包從外周血中提取全基因組，DNA 濃度檢測儀用于確定DNA 的純度，DNA 保存在-80 ℃冰 箱 中。 注：DNA 工 具 包（Takara Company，Japan）DNA concentration detector（NANODROP2000，Thermo）。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因類型檢查 根據人類基因組計劃1000 提供的數據，用Haploview 軟件選擇四組SIRT1核苷酸片段，分別命名為：rs33957861、rs11599176、rs12413112、rs35689145。基因類型檢測應用西格諾質譜分析平臺（Sequenom，Son Diego，CA），PCR 引物用質譜分析軟件3.1 設計，PCR 多通道反應系統包括2 μL DNA樣本（2.5 ng/μL），水2.18 μL，反應緩沖液0.5 μL ，MgCl2（25 mmol/L）0.5 μL，dNTP 混合物（10 mmol/L）0.1 μL，引物混合物（1 μmol/L）0.5 μL。PCR 反應條件如下：95 ℃15 min，然后95 ℃20 s，5 個循環；65 ℃30 s，72 ℃1 min，然后95 ℃20 s，5 個循環；58 ℃30 s，72 ℃1 min，以72 ℃30 min 結束。堿性磷酸酶活性和iPLEX 擴增反應過程依據廠家說明書進行。每次吸取15~25 μL 標本置于光譜分析儀，利用西格諾質譜儀進行分析，下一步用Mass Array Typer 3.4 軟件，根據擴增產物確定基因類型。

1.2.2 統計學分析 所有數據用SPSS 22.0 統計軟件包進行統計分析，計量資料采用-X±S表示，方差分析統計分析。計數資料用百分數和率表示，χ2檢驗進行統計分析，OR 值和95% 的可信區間分析采用非條件回歸分析，基因多態性、體重和疾病的關系用多元回歸分析，基因的單倍型用SHEsis 分析，P<0.05 為有統計學差異。

2 結果分析

2.1 研究對象的一般臨床特征

如表1 顯示，各組間的年齡、性別、隨機血糖比較無統計學差異（P>0.05）。與健康和飲酒對照組相比，NAFLD 組的體重指數（BMI），谷丙轉氨酶（ALT），谷草轉氨酶（AST），堿性磷酸酶（ALP），膽固醇（Cholesterol），AFLD 組的BMI，ALT，AST，ALP，膽紅素（Bilirubin），Cholesterol 顯著升高（P<0.05）。而且，與健康對照組相比，酒精對照組的BMI 顯著增加（P<0.05）。另外，與NAFLD 組相比，AFLD 組，Cholesterol，ALT，AST 顯著升高（P<0.05）。兩組間，其它臨床指標沒有明顯差異（P>0.05）。與其它三組比較，AFLD 組，膽紅素顯著升高（P<0.05）。

表1 研究對象的一般臨床指標比較Tab.1 Comparison of the general characteristics of the study subjects in different groups

2.2 SIRT1 基因四組核苷酸與酒精性脂肪肝發病風險的相關性

非條件回歸分析和FDR 矯正（表2）顯示，與健康對照組和飲酒對照組，攜帶rs33957861 C>T，rs11599176 A>G，rs12413112 A>G 的個體，AFLD 和NAFLD 的發病風險明顯降低，而攜帶rs35689145的個體，AFLD 和NAFLD 的發病風險上升（均為P<0.05）。另外，與CC 和AA 基因型比較，rs33957861 C>T 的CT+TT，rs11599176 A>G 的AG+GG，rs12413112 A>G 的AG+GG 降低AFLD 的發病風險，然而，與CC 基因型比較，rs35689145 A>G 基因型AG+GG 明顯增加AFLD 的發病風險。在NAFLD和AFLD 及健康對照組、飲酒對照組四組中，四組核苷酸的基因頻率無明顯差異（均為P>0.05）。另外，如表3 所示，用在線的SHEsis 軟件行單倍體分析顯示單倍體AAAA，CAGA 和CGAA 能明顯降低酒精性脂肪肝的發病風險；相反，CAAG 增加AFLD 的發病風險（均為P<0.05）。

表2 SIRT1 基因四組核苷酸和NAFLD 及AFLD 的相關性Tab.2 Correlation analysis of four SNPs of within the SIRT1 gene and the risk of NAFLD and AFLD

表3 SIRT1 基因四組核苷酸單倍型與AFLD 的相關性分析Tab.3 Correlation analysis of haplotype of four SNPs within the SIRT1 gene with AFLD

2.3 SIRT1 基因四組核苷酸和各組BMI 的關系

就NAFLD 和AFLD 組而言，與CT+TT 基因型比較，攜帶rs33957861 CC 基因型的個體BMI 較高（圖1）。另外，與AG+GG 基因型比較，rs11599176，rs12413112 的AA 基因型攜帶者BMI 較高。然而，與AG+GG 基因型比較，rs35689145 的AA 基因型有較低的BMI（均P<0.05）。在飲酒對照組，與rs33957861的CC 基因型，rs11599176 的AA 基因型比較，CT+TT 和AG+GG 基因型BMI 較低（均為P<0.05）。而且，在健康對照組，與rs11599176，rs12413112，rs35689145 的AG+GG 基因型比較，rs11599176，rs12413112的AA 基因型有更高的BMI，然而，攜帶rs35689145 AA 基因型的有較低的BMI（均為P<0.05）。而且，多重回歸分析顯示，rs33957861 C>T，rs11599176 A>G 和BMI 是AFLD 的獨立危險因素（表4）。

圖1 SIRT1 基因四組核苷酸和各組BMI 的關系Fig.1 Association of four SNPs within the SIRT1 gene and BMI in subjects from different groups

表4 將健康對照組作為參照組進行多元多級回歸分析Tab.4 Multivariate polychotomous logistic regression by taking healthy control as a referent group

3 討論

SIRT1 是介導多條細胞信號轉導途徑的關鍵轉錄因子，在調節能量穩態方面起著至關重要作用。人類SIRT1基因定位于染色體10q22.1，基因長度為33 000 bp，編碼的蛋白相對分子質量為120 000，由1 500 個氨基酸殘基組成，包含9 個外顯子和8 個內含子。本研究選擇的SIRT1基因的四組核苷酸rs33957861，rs11599176，rs12413112，rs35689145 均位于內含子。

乙醇對多種調節因子的作用，全部或部分通過抑制中樞信號分子SIRT1 來介導的，SIRT1 相關信號通路參與AFLD 的發生，但具體的調節機制尚未完全明確，基因水平的研究可能揭示SIRT1 參與AFLD 的發病機制。既往研究顯示：SIRT1 激動劑白蘆藜醇可明顯減輕脂質相關代謝性肝損傷［10］，另一項研究［11］顯示：丹酚酸B 可明顯增加SIRT1 的表達，減少C 反應蛋白（CRP）等相關炎癥介質水平，減輕大鼠模型的酒精性肝損傷，最近的一項研究［12］發現：敲除小腸SIRT1 對乙醇誘導的小鼠炎癥和肝損傷具有保護作用，提示腸道SIRT1 缺乏對乙醇相關肝損傷的保護作用。肝臟的SIRT1 對于酒精性肝損害具有保護作用，而腸道SIRT1作用相反，提示SIRT1 的調節機制具有組織特異性，具體調節機制如何，下調或上調是如何實現的呢？本研究發現，SIRT1基因四組核苷酸與酒精性脂肪肝病的敏感性相關，不同個體對AFLD 的敏感性不同，可能與攜帶的核苷酸類型有關，SIRT1 對于酒精性肝損害的調節機制非常復雜，不是所有的SIRT1核苷酸對于酒精性肝損害具有保護作用，部分核苷酸會升高ALD 的發生風險，所以單純調高SIRT1 的水平，不一定會減輕酒精性肝損害，一些對于酒精性肝損傷具有保護作用的SIRT1 激動劑，可能是激活了部分有益的核苷酸，抑制了有害的核苷酸，不同組織中的SIRT1 對于酒精性肝損害的作用不同，但具體機制有待進一步研究，而且本研究僅僅涉及內含子的四條核苷酸，其它與AFLD 相關的核苷酸有待進一步發現及研究。

眾所周知，體重指數高的個體通常有過多的脂肪沉積，尤其在肝臟。除了提供能量供應，肝臟中的脂肪酸合成中性脂肪，但過多的中性脂肪超過載脂蛋白的轉運能力，最終導致脂肪肝的發生［13-14］。最重要的是脂肪肝患者通常有明顯高的體重指數，但是，隨著體重指數的下降，肝臟的脂肪沉積下降，脂肪肝可以緩解，以上說明：脂肪肝的發展隨著體重指數的增加而發展［15］。而且，以前的臨床研究證實了SIRT1基因多態性和體重指數的密切關系。一項研究發現，SIRT1基因（rs10509291 和rs10823116）中，820 例非糖尿病個體中，一般等位基因的變異與升高的體重指數（>23 kg/m2）相關［16］。另外，Zillikens 等［17］發現：在兩個獨立的群體中，SIRT1基因的rs7895833 和rs1467568 最小等位基因與較低的體重指數是相關的。意大利的一項研究［18］發現：對21 例神經性厭食癥患者，26 例正常體重和75 例肥胖患者進行了評價，結果發現厭食癥患者SIRT1 顯著高于正常體重和肥胖患者（分別為（3.27±2.98）、（2.27±1.13）和（1.36±1.31）ng/mL）。根據年齡和性別調整的每個預測變量的線性回歸模型表明，SIRT1 濃度與BMI 呈顯著負相關。本研究顯示體重指數和SIRT1基因多態性在酒精性脂肪肝病的發病風險中扮演著重要的角色，這與以前大量的研究一致。本研究發現，在非酒精性脂肪肝病和酒精性脂肪肝病個體中，攜帶SIRT1基因rs33957861，rs11599176 ，rs12413112 突變基因型體重指數較低，然而，攜帶rs35689145 突變型者體重指數較高。通過logistic 回歸分析，rs33957861 C>T，rs11599176 A>G 和體重指數是酒精性脂肪肝的獨立危險因素。與本研究相似，Clark 等［19］證實這四組核苷酸和體重指數有密切的聯系。一項來自日本的研究［20］發現，在無卡路里限制（CR）組中，具有rs1467568 G 等位基因的女性比沒有的BMI 更高（P＝0.02），此外，具有rs7895833 A或rs1467568 G 等位基因的婦女，與沒有這些等位基因的婦女，從20 歲開始體重增加更加明顯（rs7895833為P=0.03，rs1467568 為P=0.003）。因此認為攜帶SIRT1基因的單核苷酸rs33957861，rs11599176 ，rs12413112 個體有較低的發生酒精性脂肪肝的風險，而攜帶rs35689145 個體有較高的發生AFLD 的風險。另外，在非酒精性脂肪肝和酒精性脂肪肝個體間，不同組間沒有明顯的差異。本研究結果顯示，在非酒精性脂肪肝和酒精性脂肪肝個體中體重指數沒有統計學差異。SIRT1基因多態性可能通過體重指數誘發脂肪肝的發生。

研究發現具有單倍體AAAA，CAGA 和CGAA 的個體發生AFLD 的概率較低，然而，CAAG 發生AFLD 的風險較高，以上的研究進一步揭示SIRT1基因多態性與患者對AFLD 的易感性密切相關。慢性大量酒精喂養的大鼠模型試驗顯示：肝細胞內SIRT1基因的過度表達可能激活SIRT1 的活性，作為對過度酒精暴露的反應，阻止脂肪的過度沉積［21］。而且，大量證據證明，SIRT1 處于抑制狀態下，過量的酒精暴露會導致酒精性脂肪肝的發生，肝內也會產生大量的炎癥因子［22］，主要是通過破壞肝細胞的營養信號網絡調節、轉錄調節及協同調節的變化。

由本研究可知，四組核苷酸與酒精性脂肪肝的發病風險和體重指數之間的關系是密切相關的。不同個體對AFLD 的敏感性不同，與攜帶的核苷酸不同可能有關。但這僅僅是內含子的四條核苷酸，其它與AFLD 相關的核苷酸有待進一步發現和研究。減肥和干擾核苷酸代謝有利于AFLD 的預防、治療。