鯉腸道內產消化酶益生菌的分離與篩選

陳書暢，徐曄，曲樂天，夏騰，劉毅，許建和，程漢良

（江蘇海洋大學海洋科學與水產學院，江蘇 連云港 222005）

鯉（Cyprinus carpio）食性廣、生長速度快，適應性強，食用價值高，是世界尤其是我國傳統的養殖魚類。隨著水產養殖業朝著高密度、集約化方向發展，提高魚體免疫力和抗病力顯得尤為重要[1]。

腸道健康對于魚類的健康養殖意義重大。腸道發揮著多種作用：消化和吸收營養物質、抵抗病原微生物和食物抗原對機體的影響、參與抗菌肽和攝食調控類激素的分泌等[2]。腸道內定植著大量微生物，這些微生物也通過自身或其代謝產物影響魚類的營養代謝、系統發育、免疫調節等生理過程[3]。許多研究表明，益生菌在宿主腸道的粘附作用具有特異性，非同源的益生菌在養殖生產中的應用效果并不理想[4]。所以種屬特異性是篩選益生菌首要條件，從水產動物腸道中分離篩選益生菌是目前大多數水產益生菌的主要篩選方法。因此，探究魚源益生菌生物特性，尋求一種高效安全的飼料添加劑型益生菌菌種勢在必行。本研究通過篩選一種安全有效、有較強產酶能力的鯉源益生菌，以期為鯉源益生菌的益生特性分析和安全使用提供參考，及為鯉益生菌制劑和發酵飼料的研發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用魚采自江蘇海洋大學水產養殖實驗室，試驗前攝食鯉配合飼料。飼料制作完成后，采用高溫高壓滅菌處理（121℃、0.5 Mpa、滅菌15 min）。每天上午10：00 和下午3：00 各投喂一次，養殖4 周；養殖期間，水中溶氧量＞5 mg/L，水溫保持在（26±1）℃。

1.2 方法

1.2.1 取樣

試驗魚饑餓24 h 后，選擇3 尾活潑、無外傷、體形正常的健康鯉，體質量（109.6±2.8）g。經MS-222麻醉，用無菌水沖洗數次，體表用75%的酒精消毒，在潔凈工作臺上，用無菌剪刀分離腸道，稱取3 尾鯉前腸共4.5 g，用滅菌生理鹽水沖洗數遍，剪碎，放入50 mL 滅菌的離心管中，加20 mL 滅菌生理鹽水，勻漿，再加20.5 mL 滅菌生理鹽水，制成10-1稀釋原液，放入4℃冰箱保存備用。

1.2.2 培養基的配制

實驗所用LB 和MRS 培養基購于北京陸橋技術有限責任公司，芽孢桿菌富集培養基的配制參照王妹等[5]的方法，淀粉培養基、脂肪培養基配制參照羅璋[6]的方法，脫脂牛乳瓊脂培養基參照沈萍等[7]的方法。

1.2.3 細菌計數

稀釋鯉腸道原液，分別取各稀釋液100 μL 均勻涂布在LB、MRS 和芽孢桿菌富集培養基上，37℃倒置培養18～24 h，參照國家標準GB 13093-91，計算各培養基中細菌的數量[8]。

1.2.4 產酶菌株的初步篩選

分別純化LB、MRS、芽孢桿菌富集培養基中的細菌，各110 株，編號為：BH1001-BH1110、BH2001-BH2110、BH3001-BH3110。取培養出的單菌落用接種環點在淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶篩選培養基上，進行篩選[9]。

1.2.5 菌株產酶活力測定

將上述篩選出的菌株分別接種于相應的液體培養基中，在28℃下培養18～24 h，4 000 r/min 離心30 min，取上清液用南京建成生物工程研究所有限公司的蛋白酶試劑盒、淀粉酶試劑盒和脂肪酶試劑盒進行測定[10]。

1.2.6 溶血試驗

溶血平板購于北京陸橋技術有限責任公司，取純化后的單菌落接入溶血瓊脂平板，37℃倒置培養24 h 后觀察是否有溶血圈生成。

1.2.7 菌株藥敏實驗

參照文獻[11]，采用藥敏紙片，每種抗菌藥物紙片（購于杭州濱和微生物試劑有限公司），均設3 個重復。實驗結果依據《WS/T125-1999 紙片法抗菌藥物敏感試驗標準》進行判斷。

1.2.8 16S rDNA 分子鑒定

采用細菌16S 通用引物（27F）：5′-AGAGTTTG ATCMTGGCTCAG-3′（1492R）：5′-TACGGYTACCTT GTTACGACTT-3′。接種單菌落于LB 液體培養基中，37℃、振蕩180 r/min，培養24 h；取2.5 μL 的上一步產物作模板。PCR 反應體系見表1。

表1 細菌16S rDNA 擴增體系Tab.1 16S rDNA amplification system of the bacteria

PCR 反應循環參數：95℃5 min，（94℃30 s，54℃30 s，72℃，30 s）共30 cycles，72℃7 min，12℃∞。

取5 μL 的PCR 產物，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。條帶大小與預期大小相同，條帶單一且明亮。PCR 產物直接送上海生工測序。

1.2.9 生理生化鑒定

參照《常見細菌系統鑒定手冊》[12]，采用細菌微量生化反應管測定分離菌株生化特征，生理生化反應管購置于杭州濱和微生物試劑有限公司，并用一株由本實驗室保存的枯草芽孢桿菌作參照菌，進行對照實驗。

1.3 數據處理

使用Excel 2010 進行數據統計分析，應用相應函數計算平均值和標準差；采用IBM SPSS Statistics 23 軟件對試驗數據進行單因素方差分析（one-way ANOVA），數據差異顯著時，采用Duncan′s 檢驗法進行多重比較，差異水平定為0.05。

2 結果與分析

2.1 鯉腸道的細菌數量

鯉腸道在LB 固體培養基中的細菌數量為4.7×1015cfu/g，MRS 固體培養基中的細菌數量為8.0×1013cfu/g，芽孢桿菌固體富集培養基中的細菌數量為6.7×1013cfu/g。

2.2 產酶菌株的初步篩選

從正常養殖的鯉腸道中分離出330 株菌株，經初步篩選，能同時產三種酶的菌株35 株,其中12 株來自LB 固體培養基，7 株來自MRS 固體培養基，16株來自芽孢桿菌富集培養基。根據菌株的透明圈直徑與菌落直徑比值結果，挑選出10 個值大的菌株BH1025、BH1065、BH1103、BH2094、BH2104、BH3 007、BH3044、BH3066、BH3080 和BH3098 進行本試驗，按順序重新進行編號J1～J10。

2.3 產酶菌株的酶活測定

各菌株產蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活力的比較結果見圖1～圖3，不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）。綜合菌株的三種產酶活力，J3、J5、J10 優于其他菌種。

圖1 各菌株產蛋白酶活力的比較Fig.1 Comparison of protease activity among different strains

圖2 各菌株產脂肪酶活力的比較Fig.2 Comparison of lipase producing activities among different strains

圖3 各菌株產淀粉酶活力的比較Fig.3 Comparison of amylase activity among different strains

2.4 菌株溶血實驗

在J1-J10 菌株溶血性試驗中，J2、J3、J5、J7、J9和J10 菌株不產生溶血圈，說明這些菌株不釋放溶血毒素，是相對安全的候選益生菌。

2.5 菌株藥敏實驗

綜合菌株的產酶能力、溶血性實驗結果，擬選J3、J5、J10 為備選益生菌株。各菌株的藥敏實驗結果見表2。菌株J3 對青霉素、紅霉素、利福平、氨芐西林和麥迪霉素抗生素產生了耐藥性，菌株J5 對青霉素抗生素產生了耐藥性，菌株J10 號對青霉素、紅霉素、環丙沙星、氯霉素、氨芐西林和麥迪霉素抗生素產生了耐藥性。菌株是否攜帶耐藥因子，是環境釋放安全與否的重要指標之一[13]，為了保證安全性，最終選定J5 為候選益生菌株。

表2 各菌株的藥敏實驗結果Tab.2 Drug sensitivity test results of each strain

2.6 16S rDNA 分子鑒定

將測得菌株J5 的16S rDNA 序列在GenBank中進行blast 序列比對。結果顯示：J5 細菌與枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis 的相似性為100%。

2.7 生理生化鑒定

擬選菌株的生理生化結果見表3。與《常見細菌系統鑒定手冊》比對，再參照16S rDNA 測序結果，最終確定J5 為Bacillus subtilis。

表3 J5 的生理生化特征Tab.3 Physiological and biochemical characteristics of J5

3 討論

本研究以篩選適合鯉飼料添加型的益生菌為主要目的。根據魚類的食性選擇合適的益生菌，草食性的魚可選擇產淀粉酶高的細菌做益生菌，肉食性的魚可選擇產脂肪酶高的細菌作益生菌。鯉為雜食性魚類，應該選擇分泌蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶能力較強的細菌作為益生菌[6]。在篩選益生菌的過程中，初步比較了細菌的產酶能力，并進一步檢測了細菌的溶血性和抗生素的敏感性，將產酶能力和安全性高、攜帶抗生素耐藥因子少的菌株篩選出作為潛在益生菌，進行下一步試驗。

益生菌通常作為疾病控制劑的輔助劑，甚至替代抗生素應用于水產養殖動物疾病防治中[14]。益生菌具有提高動物消化吸收飼料的重要作用[15-17]。本實驗初篩具有同時產蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶能力的菌株35 株，選取10 種透明圈直徑/菌落直徑較大的菌株，進一步測定產酶能力，發現比值的大小與菌株產酶能力的大小并不具有很強的相關性，產酶能力的高低須經具體測定酶活方可確定。產蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活力比較分析表明，J3、J5、J10 產酶活力強。

益生菌的篩選到應用存在著安全隱患，候選菌株是否具有較強的抗藥性，是否產生溶血毒素都是必須要考慮的問題。本實驗進行了菌株藥敏性和溶血實驗，發現部分菌株具有很強的耐藥性，尤其是對常見的抗生素，這可能與魚類養殖中頻繁使用抗生素有關。黃志堅等[18]檢測了194 株（62 個屬）分離自水產養殖生物和養殖環境的革蘭氏陰性菌和陽性菌對5 種常用抗生素的抗性。結果表明水產養殖生物和養殖環境中均存在不同程度的抗生素污染。部分菌株在進行溶血實驗時存在著較大的溶血圈，表明這些菌株會產生溶血毒素，是潛在的致病菌，應排除在候選益生菌之外。綜合產酶能力和細菌的溶血性結果，菌株J3、J5 和J10 更具有開發前景。但菌株J3 對5 種抗生素產生了耐藥性，菌株J10 號對6 種抗生素產生了耐藥性。該菌株中可能存在耐藥因子，這是環境釋放安全與否的重要指標之一[11]，所以為了保證安全性，應將該菌株舍棄。

結論

菌株J5 具有較強的分泌蛋白酶、淀粉酶和淀粉酶能力；對絕大多數抗生素敏感，安全性更好，參照16 S rDNA 測序結果，并與《常見細菌系統鑒定手冊》比對，最終確定J5 為枯草芽孢桿菌。該菌是我國農業農村部批準的可以作為飼料添加劑的微生物菌種，更具有開發前景。